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几丁质酶有抑真菌和杀虫增效的作用。因此苏云金芽孢杆菌(简称Bt)几丁质酶的研究对于扩大Bt制剂的作用范围,增强其杀虫作用有重要的意义。
本文利用几丁质平板法和chiB特异引物PCR两种方法检测了445株苏云金芽孢杆菌。平板检测结果表明,被测菌株都可以在以胶体几丁质为唯一碳源的培养基上生长,证明Bt菌株普遍含有几丁质酶。71.3%的菌株可以产生明显水解圈,其中16.4%的菌株能产生较大的水解圈,具有较高的几丁质酶活性。基因检测的结果表明91.7%的菌株含有chiB基因。实验分别从酶水平和基因水平证明几丁质酶及其基因在Bt普遍存在。
通过分析Bt几丁质酶与其血清型和杀虫晶体蛋白(ICP)的关系证明,几丁质酶活性的高低与这两者之间没有必然联系。对峙法检测了54株几丁质酶活性较高的苏云金芽孢杆菌,筛选到12株抑小麦赤霉菌效果好的菌株。@2 以苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3(Bt 15A3)菌株基因组DNA为模版,用touchdown PCR方法扩增几丁质酶ChiA和ChiB的全基因序列(GenBank登录号:EF 103273和DQ 512474)。将PCR产物连接pUCm-T克隆载体,分别转化E.coli XL-Blue,获得重组质粒pUCm-cMA和pUCm-ch/B。经核苷酸及对应氨基酸序列分析证明,chiA基因全长1426bp,含有343 bp的上游非编码区和1083 bp的ORF,编码360个氨基酸。推测蛋白分子量36kD,只有一个几丁质酶催化域。chiB基因全长2279 bp,含有248 bp的上游非编码区和2031 bp的ORF,编码676个氨基酸。推测蛋白分子量71kD,具有三个相关结构域。
在有无诱导物的培养基中分别培养E.coli(pUCm-chiA)和Ecoli(pUCm-chiB)发现,克隆的几丁质酶基因可以利用本身的启动子异源表达各自分子量的蛋白,不需要几丁质作为诱导物。证明Bt.15A3中两种几丁质酶是组成型表达。
ChiA和ChiB几丁质酶的最适pH为5.5左右。最适温度为55℃左右,并且两种酶对pH和温度的适应能力较强,pH9.0时有50%的酶活力,温度在70℃时,保持60%的酶活力。Mn<2+>能够抑制ChiA和ChiB的几丁质酶活性,Ca<2+>则对ChiA有促进作用,对ChiB有抑制作用。
异源表达的ChiA和ChiB,对黑曲霉的孢子萌发和菌丝生长有抑制作用,并可以提高Vip蛋白对甜菜夜蛾的杀虫活性。