目的核基质是构成细胞核的三维网架体系,其主要成分是非组蛋白,有组织、细胞特异性。大量的研究表明,核基质不仅在维持细胞核的形态结构,而且在染色质/体构建、DNA复制、基因表达调控和DNA的损伤修复等细胞生命活动中起重要作用。近年来,核基质蛋白成分、结构和功能在肿瘤发生、发展中的作用一直是人们研究的热点问题之一。探讨肿瘤细胞核基质蛋白的改变,不仅有利于寻找肿瘤标志物,也有助于阐明肿瘤活性基因表达调控机理并发现肿瘤治疗新的药物靶点。本实验旨在系统研究食管癌相关核基质蛋白,首先观察食管癌细胞核基质的超微结构;进而探讨三氧化二砷对食管癌细胞核基质蛋白的影响;最后通过比较永生化食管上皮细胞和食管癌细胞之间差异核基质蛋白,寻找食管癌变相关蛋白;以深入了解食管癌变与核基质的关系,填补该研究领域的空白,为进一步研究食管癌发生机理及筛选食管癌的特异分子标志物奠定基础。材料与方法1.细胞及其培养;食管低分化鳞癌细胞株EC1和高分化鳞癌细胞株EC18均培养于含10%小牛血清的RPMI 1640中;永生化食管上皮细胞SHEE和由SHEE转化而来的食管癌细胞SHEEC在含10%小牛血清的DMEM/F12培养基中培养。2.用于超微结构观察之核基质抽提和样品制备;收集培养的EC1、EC18细胞经非离子去垢剂选择性抽提,核酸酶消化,硫酸铵溶解组蛋白后,提取核基质,2.5%戊二醛/CSK溶液4℃固定,1%锇酸后固定,经DGD包埋-去包埋剂制样,切片厚0.2μm,透射电镜观察,摄片。3.细胞生长曲线和细胞周期测定;1×10⁴/孔EC1细胞接种于24孔培养板中,隔日加入终浓度分别为0.5μmol/L、2μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的As₂ O₃,以未加入As₂ O₃处理的EC1细胞作对照。每隔24h用0.4%台盼蓝染色计数活细胞,以活细胞的百分数即实验组活细胞数/对照组活细胞数显示数据。EC1细胞经2μmol/L和5μmol/L As₂O₃分别作用24h、48h和72h,胰酶消化制备细胞悬液。冷乙醇固定,PI染色,流式细胞仪检测各组标本的细胞周期。每组设6个样本。4.原位核基质制备及免疫细胞化学染色;EC1细胞经2μmol/L As₂O₃处理48h,原位提取核基质,免疫细胞化学染色（ABC法）,检测核基质蛋白HSP70、HSC70、NuMA、TopoⅡα的表达。5.核基质蛋白提取及免疫印迹分析;收获经2μmol/L As₂O₃处理48h的EC1细胞及未处理的对照细胞,提取核基质蛋白,并经透析和超速离心去除中间纤维,SDS-PAGE分离,转移至硝酸纤维素膜,ECL化学发光法检测核基质蛋白HSP70、HSC70、NuMA、Lamin A/C和Actin的表达。6.固相pH梯度双向凝胶电泳和MALDI-TOF-MS分析;提取永生化食管上皮细胞SHEE和食管癌细胞SHEEC核基质蛋白,固相pH梯度双向凝胶电泳分离核基质蛋白,凝胶经银染后,使用PDQuest6.2软件分析两组细胞的双向凝胶电泳图谱,获取差异核基质蛋白点。应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱得到部分差异核基质蛋白的肽质量指纹图谱,搜索数据库鉴定差异核基质蛋白质。7.PMS2的RT-PCR分析;TRIzol试剂提取SHEE和SHEEC细胞的总RNA。反转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板进行PMS2 PCR扩增,检测PMS2 mRNA在二种细胞的差异表达。结果1.食管癌细胞核基质—核纤层—中间丝的形态结构;电镜下观察,EC1和EC18细胞均存在精细发达的核基质—核纤层—中间丝结构体系。核基质网络由纤维结构和许多附着在纤维上的致密颗粒组成。纤维粗细相似,均匀地遍布于整个细胞核中,致密颗粒大小不一。核纤层连续包绕细胞核,向内与核基质纤维连接,向外与细胞质内的中间丝连接。中间丝分布于细胞质中,呈索状结构。随着核基质抽提时的DNase浓度提高,细胞核基质密度降低。EC1的核基质与EC18相比,纤维更加细密。此外,有些细胞核内尚可看到核仁基质,也是由纤维样结构和颗粒样结构组成,纤维聚集成团,比核基质更加致密,周围与核基质纤维相连。2.As₂O₃抑制EC1细胞的生长和细胞周期阻滞;相差显微镜下观察,对照组细胞贴壁生长,少量分裂期细胞呈圆形,细胞轮廓清晰,折光性好。2μmol/L As₂O₃作用24h后,贴壁细胞数量减少,圆形细胞明显增多,细胞阻滞在分裂期。随着As₂O₃作用时间和浓度的增加,细胞数量进一步减少,细胞活力下降,形态大小不一,细胞皱缩,表面出芽,核固缩、碎裂。流式细胞仪检测结果显示As₂O₃能使G2/M期细胞比例增加。5μmol/L较2μmol/L作用明显,作用48h时较24h明显。但As₂O₃作用72h后G2/M期细胞的比例反而下降。3.As₂O₃对核基质蛋白表达的影响;免疫细胞化学染色显示,EC1细胞经2μmol/L As₂O₃处理48h后,细胞核基质中,HSP70、HSC70染色均呈强阳性,以HSP70染色更深,阳性反应在整个细胞核内均匀分布;未经处理的对照细胞,均呈弱阳性反应。NuMA染色显著增强,在部分细胞由原来的细颗粒状阳性反应,浓集成团块状。TopoⅡα的染色与对照相比,也明显增强。免疫印迹分析显示,与对照细胞相比,HSP70、HSC70和NuMA的免疫印迹条带增强,而Lamin·A/C和Actin的免疫印迹条带减弱。4.双向凝胶电泳和MALDI-TOF-MS分析;结果显示,应用优化的双向凝胶电泳条件,我们获得了分辨率高、重复性好的人食管上皮细胞双向电泳图谱,发现人永生化食管上皮细胞SHEE和食管癌细胞SHEEC之间表达量相差4倍以上的差异核基质蛋白点25个。经MALDI-TOF-MS分析获得相应蛋白点的肽质量指纹图谱,搜索SwissProt数据库,初步鉴定出差异核基质蛋白12种。它们分别是与细胞增生、分化、凋亡、周期调控、信号转导、基因修复、钙结合蛋白、分子伴侣等有关的蛋白质。5.PMS2的RT-PCR分析;RT-PCR进一步证实与DNA错配修复相关的PMS2 mRNA在SHEE的表达高于SHEEC。结论1.在食管癌细胞中核基质-核纤层-中间丝形成一个连续的体系,对维持细胞核的完整性和细胞功能起重要作用。细胞核基质密度与细胞分化程度、DNase处理浓度等因素密切相关。2.低浓度As₂O₃在体外能显著抑制人食管癌细胞EC1生长,引起细胞G2/M期阻滞。在这一过程中,多种核基质蛋白如HSP70、HSC70,和核基质结构蛋白如NuMA、TopoⅡα、Lamin A/C、Actin的表达发生改变,表明核基质可能是As₂O₃发挥抗肿瘤作用的靶点之一。3.蛋白质组学技术是进行癌变相关差异表达蛋白质研究的一种有效手段。食管上皮细胞癌变过程中,出现了若干核基质蛋白的变化,我们已鉴定的一些与食管癌变相关的差异核基质蛋白,为进一步探讨食管癌发生机理及筛选食管癌的特异分子标志物奠定了基础,可能对食管癌的诊断、治疗具有重要意义。