论文部分内容阅读
大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌引起的严重危害大豆生产的毁灭性病害之一。近年来,大豆疫霉根腐病在我国大豆主产区呈逐渐扩大蔓延的趋势,并造成重大的经济损失。合理利用抗、耐病品种是防治该病最经济有效的途径,然而大豆疫霉生理小种进化速度快、毒力结构趋于复杂化,常规育种工作周期长,抗性资源有限,很难满足生产的需要。因此,研究大豆与疫霉互作的分子机理则是解释病害发生机制,解决该问题的根本途径之一。植物在发育过程中为了抵御病原物的侵染,逐渐形成并完善了一系列复杂有效的保护机制和防御网络。植物miRNA通过指导靶基因的转录后调控,在植物防卫反应中起着重要作用。gma-miRl510是本实验室前期利用生物芯片技术鉴定的一个参与大豆响应疫霉菌侵染的miRNA,其预测靶基因能够编码NB-LRR型抗病蛋白,本研究通过5’-RACE方法鉴定其靶标基因,并将gma-miR1510在大豆发状根组织中过表达,研究其在大豆一大豆疫霉互作过程中的功能。WRKY转录因子作为植物中最大的转录调节因子家族之一,是调节植物生理过程信号网络的重要组成成分,本研究通过RNA干扰的方法,将GmWRKY40基因进行沉默,研究其在大豆响应疫霉根腐病过程中的功能。主要研究结果如下:1.gma-miR1510在大豆抗疫霉根腐病中的功能研究(1)gma-miR1510在大豆疫霉胁迫下被抑制下调表达利用stem-loop qRT-PCR检测gma-miR1510在大豆Williams接种疫霉后的表达情况,结果发现随着接种时间其表达呈下调趋势,表明gma-miR1510很可能参与大豆与大豆疫霉根腐病的互作。(2)鉴定到Glyma.16G135500为gma-miR1510的靶标基因在线预测的gma-miR1510的大多数靶基因编码NB-LRR型抗病蛋白,利用5’-RACE方法鉴定到gma-miR1510的其中一个靶标基因Glyma.16G135500,该基因编码典型的TIR和NB-LRR植物抗病结构域。在大豆与疫霉菌互作过程中,gma-miR1510与Glyma.16G135500的表达呈负相关;在gma-miR1510a/b过表达的发状根中,Glyma.16G135500的表达明显受抑制,由此确定Glyma.16G135500是gma-miR1510的靶基因。(3)gma-miR1510a和Glyma.16G135500的启动子中分布有胁迫响应元件使用PlantCARE数据库对gma-miR1510a和Glyma.16G135500启动子的顺式作用元件分析结果显示,存在一些真菌激发子响应元件、防卫与胁迫响应元件和响应多种激素的顺式作用元件,表明两者很可能参与大豆对生物胁迫的响应。(4)过表达gma-miR1510减弱大豆对疫霉菌的抗性分别对过表达gma-miR1510的转基因发状根和对照接种大豆疫霉游动孢子,对成功侵染以及有卵孢子萌发的发状根数进行统计,结果发现过表达gma-miR1510a/b的发状根被成功侵染以及产生卵孢子的概率明显高于对照;接种疫霉后过表达miRNA的发状根中疫霉菌丝积累量明显高于对照,结果同样表明gma-miR1510a/b负向调控大豆对疫霉菌的抗性。2.GmWRKY40转录因子在大豆抗疫霉根腐病中的功能研究(1)GmWRKY40受大豆疫霉菌及各种外源激素的诱导表达荧光定量结果显示,GmWRY40基因的表达受大豆疫霉、外源激素SA、MeJA、ETH和ABA的诱导上调表达,表明GmWRKY40可能通过调节植物激素信号途径而参与植物对病原物的响应。(2)GmWRKY40定位于细胞核中构建GFP融合表达载体pBIN-WRKY40-GFP,利用农杆菌介导的瞬时表达体系研究其在细胞中的定位情况,结果表明GmWRKY40蛋白主要分布于细胞核中。(3)GmWRKY40参与大豆的基础防卫反应在Williams(rps)中沉默GmWRKY40,阳性发状根接种疫霉后的统计结果显示,沉默GmWRKY40的发状根接种P6497后的病斑长度明显长于空载体对照;对侵染的转基因组织中疫霉积累量的检测结果显示明显高于对照,表明GmWRKY40参与了大豆的基础防卫反应。(4)沉默GmWRKY40降低大豆对疫霉菌的小种专化抗性沉默GmWRKY40的Williams 82(Rps 1k)转基因发状根和对照接种疫霉游动孢子,对成功侵染以及有卵孢子萌发的发状根数进行统计,结果发现沉默GmWRY40的发状根被成功侵染以及产生卵孢子的概率明显高于对照;接种疫霉后沉默转基因发状根中疫霉菌丝积累量明显高于对照,结果表明GmWRKY40参与大豆对大豆疫霉菌的响应,沉默GmWRKY40减弱了其专化抗病性。对疫霉侵染后的转基因发状根组织进行DAB染色及H2O2含量的测定,结果显示,沉默GmWRKY40的发状根中过氧化氢的积累明显低于空载体对照中H2O2的含量。接种后,与H2O2合成相关的NADPHox基因表达量明显低于对照,而与清除相关的APX1基因的表达与对照相比则显著上调,受H2O2诱导的GST的表达量在沉默GmWRKY40的发状根中显著降低。表明疫霉侵染过程中GmWRK40参与H202的积累。对转基因和对照发状根接种疫霉前后SA和JA信号通路相关基因的表达差异进行分析,结果表明,SA信号通路标志基因NPR1在接种后的沉默转基因组织中相比于对照显著下调,基因PR1a和PR5在接种前后的表达水平均低于对照;JA信号通路标志基因PDF1.2在接种后的诱导水平显著低于对照,表明GmWRKY40可以激活SA和JA信号通路。(5)GmWRKY40与JAZ家族蛋白互作通过筛选酵母cDNA文库,鉴定到2个JAZ蛋白、1个锌指蛋白与GmWRKY40发生互作,进一步分析JAZ家族蛋白与GmWRKY40的互作情况,结果发现GmWRKY40可以与8个JAZ家族的蛋白互作,当GmWRKY40蛋白的WRKY结构域或Zinc finger结构域突变后,它们之间的互作则不同程度的被抑制。