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研究背景和目的淋巴管生成,指淋巴管的发育和增殖。在胚胎发育过程中,淋巴管生成是一种生理现象。但是淋巴管生成也会出现在很多病理情况中,如肿瘤转移、炎症、伤口愈合和移植排斥。最近研究表明,在肾脏纤维化的患者和动物模型中同样发现淋巴管生成这一现象。目前巨噬细胞被认为是参与淋巴管生成最主要的炎症细胞。但是巨噬细胞调控肾脏淋巴管生成的具体机制尚未阐明。此研究中,我们通过主要表达在单核/巨噬细胞表面的单核细胞趋化蛋白受体1（C-Cmotif chemokine receptor2,CCR2）研究巨噬细胞具体介导肾脏淋巴管生成的作用及其机制。研究方法和结果我们首先利用Ccr2基因敲除(Ccr2-/-)小鼠和野生型C57BL/6（WT）建立早期（5天）和晚期（14天）单侧输尿管结扎（Unilateral ureteral obstruction,UUO）肾脏纤维化模型。通过PAS、Masson病理染色及纤维化指标（fibronectin/collagneI/α-SMA）免疫印迹,发现Ccr2基因敲除后肾脏损伤和纤维化明显减轻。通过小鼠淋巴管特异性标记淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE-1）和细胞增殖标记Ki67的免疫荧光发现,Ccr2-/-小鼠肾脏淋巴管及增殖的淋巴管内皮细胞数目都明显少于WT小鼠。这表明Ccr2基因敲除后一方面能减轻肾脏损伤和纤维化,同时还能抑制UUO手术导致的肾脏淋巴管生成。利用免疫印迹及RT-PCR检测到Ccr2-/-小鼠肾脏血管内皮生长因子C（Vascular endothelial growth factor C,VEGF-C）的蛋白和mRNA水平皆低于WT小鼠。我们利用肾脏组织连续切片VEGF-C和肾小管上皮细胞标记-水通道蛋白1（aquaporin 1）的免疫组化发现,大部分肾小管上皮细胞都表达VEGF-C。然而,Ccr2基因敲除并不影响5天或14天UUO术后肾小管表达VEGF-C的水平。另外,免疫组化结果表明Ccr2-/-小鼠UUO术后肾脏浸润的F4/80阳性巨噬细胞明显少于WT小鼠。免疫荧光双染结果表明UUO术后肾脏F4/80阳性巨噬细胞能表达高水平VEGF-C。但是Ccr2基因敲除后,不仅表达VEGF-C的巨噬细胞数目减少,而且以上巨噬细胞表达的VEGF-C水平也减低。这表明Ccr2基因敲除后肾脏VEGF-C表达下降与肾小管无关,但是与浸润减少的巨噬细胞密切相关。肾脏连续切片免疫组化中F4/80、VEGF-C及LYVE-1的共定位提示,巨噬细胞可能通过分泌VEGF-C给肾脏淋巴管生成提供一个微环境。接下来,LYVE-1免疫荧光结果表明,消除巨噬细胞能明显抑制肾脏淋巴管生成。另外,我们将野生型小鼠骨髓来源巨噬细胞（Wild type Bone marrow derived macrophages,WTBMDMs）输注到Ccr2-/-小鼠肾脏,通过免疫荧光和免疫印迹检测到Ccr2-/-小鼠减少的淋巴管生成和VEGF-C表达被逆转。这表明Ccr2基因敲除抑制肾脏淋巴管生成与巨噬细胞表达VEGF-C减少密切相关。进一步机制研究中,利用免疫印迹检测到UUO术后CCR2下游的PI3K-AKT-mTOR通路磷酸化蛋白表达水平明显升高,另外PI3K-AKT-mTOR信号通路下游的缺氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α）表达水平也明显升高。但是Ccr2-/-小鼠以上相关蛋白水平明显低于WT小鼠。接下来的EMSA结果表明Ccr2-/-小鼠肾脏HIF-1α的DNA结合能力明显弱于WT小鼠。通过免疫荧光我们发现HIF-1α主要表达在巨噬细胞核内。骨髓来源巨噬细胞HIF-1α染色质免疫共沉淀结果表明HIF-1α能直接结合在VEGF-C启动子区的-498bp位置。VEGF-C启动子荧光素酶报告基因结果进一步确定HIF-1α能直接结合在VEGF-C的启动子区进而促进VEGF-C的转录。我们还用单核细胞趋化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1）分别刺激Ccr2-/-BMDMs和WT BMDMs,免疫印迹结果发现,WT BMDMs中的VEGF-C表达水平明显升高,伴随磷酸化PI3K/AKT/mTOR和HIF-1α蛋白水平的升高,但是Ccr2-/-BMDMs中这些蛋白的表达水平没有明显升高。另外,分别用PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α抑制剂都能下调 MCP-1 刺激 WT BMDMs 表达 VEGF-C 的水平,用蛋白磷酸酶抑制剂却能上调MCP-1刺激Ccr2-/-BMDMs下游HIF-1 α和VEGF-C的表达。总之,这说明CCR2通过PI3K-AKT-mTOR信号通路和HIF-1α/VEGF-C表达来调控肾脏淋巴管生成。结论我们的研究证实了巨噬细胞在UUO术后肾脏淋巴管生成中扮演重要角色,其中巨噬细胞表面的CCR2在此过程中起关键作用。同时我们验证了巨噬细胞的CCR2首先通过激活下游的PI3K-AKT-mTOR信号通路,然后促进HIF-1α的表达,最后HIF-1α通过直接结合到VEGF-C的启动子区并促进VEGF-C的转录和表达,从而促进肾脏淋巴管生成。