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目的本课题应用双环己酮草酰二腙(Cuprizone,CPZ)诱导C57BL/6小鼠建立中枢神经系统(Central nervous system,CNS)脱髓鞘模型,给予白果内酯(Bilobalide,BB)进行干预。观察给药后动物的行为学表现、髓鞘保护、外周免疫调节及抑制小胶质细胞向M1型活化的细胞和分子机制。阐明BB治疗CNS脱髓鞘损害的靶点和途径,为今后应用BB治疗多发性硬化(multiple sclerosis,MS)提供科学的理论依据。方法本实验采用6周龄C57BL/6雄性小鼠,建立CPZ诱导的C57/BL6小鼠脱髓鞘模型。小鼠分为正常组、模型组、BB治疗组,每组8只小鼠,正常组小鼠正常饲料饲育6周,模型组和BB治疗组小鼠用含0.2%CPZ的粉末饲料饲育6周。在喂食后的第四周末(第28天)开始,BB治疗组腹腔注射给予BB,每日给药一次,连续给药至喂食后的第六周末(第42天),同时正常组、模型组每日给予生理盐水腹腔注射,并在给药期间进行行为学检测,并从造模开始记录动物的体重。在第六周结束时处死动物,眼眶取血,取脾脏、脑组织,分离脾脏单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),将脑组织分为提取蛋白质和固定两部分。进行Luxol Fast Blue染色、Black Gold II染色、MBP免疫荧光染色等来观察髓鞘形态及脱失情况;Western blot法检测MBP的表达;ELASA法测定血清、上清及脑内相关细胞因子的释放;流式细胞术检测CD4~+T细胞及B细胞亚群的变化;免疫荧光染色观察胶质细胞的变化。各组实验数据应用GraphPad Prism 5.0统计软件进行统计分析。结果1.在CPZ喂食的第一周,与正常饮食的小鼠相比,CPZ喂养的小鼠体重明显下降,并且在随后的三周内保持稳定且较低的体重。随后两周,与模型组相比,BB治疗组小鼠体重普遍升高,且行为学表现明显改善。高架十字迷宫检测,模型组开放臂进入次数百分比为(6.05±0.76)%,BB治疗组开放臂进入次数百分比为(10.4±1.97)%,p<0.05;垂直木实验中,模型组所用时间(15.29±1.24)s,BB治疗组所用时间(12.05±1.15)s,p<0.05。2.胼胝体固蓝染色、黑金染色、MBP染色均可见,模型组髓鞘脱失严重,BB治疗组髓鞘脱失较模型组明显减轻。固蓝染色中,模型组胼胝体着色面积为(3.17±0.65)*10~4,BB治疗组为(4.41±3.33)*10~4,两组比较有统计学意义(p<0.05);黑金染色中,模型组胼胝体着色面积为(11.31±0.61)*10~4,BB治疗组为(29.56±5.17)*10~4,两两比较有统计学差异(p<0.05);MBP染色,模型组胼胝体着色面积为(9.67±2.13)*10~2,BB治疗组为(19.86±4.22)*10~2,两组比较,差异有统计学意义(p<0.05)。3.Western blot法检测髓鞘碱性蛋白MBP的表达,BB治疗组MBP的表达明显升高,与模型组相比,差异有统计学意义(p<0.05)。4.ELISA检测MOG抗体的产生及培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度。结果显示,与模型组相比,BB治疗组明显抑制IL-1β(模型组120.5±1.04,BB治疗组28.8±0.85,p<0.001)、IL-6(模型组298.3±2.75,BB治疗组114.5±3.19,p<0.001)的表达,TNF-α没有显著变化。5.流式细胞术检测发现,脾淋巴细胞中CD4~+IL-17~+、CD4~+IFN-γ~+无明显改变。免疫荧光染色显示,模型组T细胞、B细胞、巨噬细胞在脑皮层中均有浸润;与模型组相比,BB治疗组T细胞(模型组3.8±0.37,BB治疗组1.2±0.2,p<0.05)、B细胞(模型组5.2±0.86,BB治疗组1.8±0.21,p<0.05)、巨噬细胞(模型组6.2±0.66,BB治疗组2.4±0.51,p<0.05)浸润情况得到明显改善,两组比较差异有统计学意义。6.免疫荧光双染检测脑内Iba1~+iNOS~+和Iba1~+NF-κB~+的表达情况。结果显示,模型组Iba1~+iNOS~+和Iba1~+NF-κB~+被大量激活,BB治疗后显著抑制了Iba1~+iNOS~+(模型组13.4±1.7,BB治疗组3.8±0.58,p<0.01)和Iba1~+NF-κB~+(模型组9.6±0.81,BB治疗组3.6±0.87,p<0.01)的表达。7.Iba-1~+与Olig4~+双染发现,模型组胼胝体、内侧隔核、纹状体部位Iba-1~+小胶质细胞迁移并聚集,造成Olig4~+少突胶质细胞的死亡,而BB给药后阻止了Iba-1~+小胶质细胞的迁移所导致的Olig4~+少突胶质细胞的损伤。结论1.BB对CPZ诱导的脱髓鞘损伤有显著的保护作用,BB治疗后小鼠的行为学和病理学均有明显的改善;可能与BB升高MBP的表达,防止髓鞘的脱失有关;2.BB可能通过抑制Iba1~+NF-κB~+炎性信号通路的激活,减少T细胞、B细胞、巨噬细胞浸润及炎性细胞因子IL-1β、IL-6的分泌,抑制MOG抗体的产生,来减轻炎性损伤;BB可以抑制小胶质细胞的激活,减轻少突胶质细胞的损伤,促进少突胶质细胞的形成。