1.背景与目的:神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)是在大脑中最常见的多肽之一,对能量代谢、食欲、心律、血压、平滑肌舒缩等的基本生物学功能发挥重要的调节作用。研究揭示中枢NPY可能参与肥胖、高胰岛素血症、高血糖症的发生。比如,侧脑室注射NPY和下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)过表达NPY均可暂时性增加试验动物食物摄入,促进胰岛素释放。新近更有研究发现NPY可通过交感神经直接作用导致肝脏胰岛素抵抗。在外周,NPY广泛分布于交感神经、肾上腺髓质、血小板和各种类型的白色脂肪组织,经由NPY受体调节脂肪生成、脂肪分解和脂肪细胞肥大。另一方面,众所周知,下丘脑前脑是交感神经系统神经束主要来源。将伪狂犬病病毒注射到脂肪组织,采用示踪显色技术观察到PVN是调控白色脂肪组织的交感神经重要来源核团。下丘脑-交感神经系统-脂肪组织轴概念的提出为阐释中枢NPY对外周白色脂肪组织发挥调节作用提供了重要的理论依据。最近研究也表明,NPY可以作为一种神经递质可以由支配脂肪组织的交感神经直接释放入局部脂肪组织,导致腹部肥胖。这些线索提示中枢PVN中NPY极可能参与外周,尤其是脂肪组织胰岛素抵抗。研究揭示NPY发挥生物学活性是通过与其结合的细胞膜上跨膜结构G蛋白偶联受体介导的,这些受体有NPY Y1,Y2,Y3和Y5受体。这些受体广泛表达于代谢相关的组织中,如脂肪组织和肝脏。有证据表明NPY主要通过Y1和Y5受体影响外周组织代谢功能。那么,NPY是否通过Y1和/或Y5受体参与外周脂肪组织胰岛素抵抗,其具体作用机制尚需进一步研究。本研究采用高脂饮食(high fat diet,HFD)以及HFD联合链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射,建立了肥胖以及糖尿病模型,观察其下丘脑NPY表达以及脂肪组织PI3K/Akt/GSK3信号通路的变化。通过下丘脑PVN原位注射重组慢病毒载体构建NPY基因过表达大鼠动物模型,观察大鼠外周组织是否发生胰岛素抵抗,探究可能参与的信号级联机制。离体实验观察NPY对胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗及摄*本课题受重庆市自然科学基金(编号:CSTC,2009BA5012)资助取的影响,结合npyy1和y5受体特异性拮抗剂进一步揭示npy诱导脂肪细胞代谢紊乱的分子生物学机制。旨在明确中枢npy与外周脂肪组织胰岛素抵抗的关系,为使用npy受体特异性拮抗剂改善由中枢npy介导代谢紊乱提供药理学依据。2.方法:2.1肥胖及糖尿病大鼠npy表达及pi3k/akt/gsk3信号通路测定大鼠hfd10周,加用或不加stz腹腔注射建立肥胖及糖尿病大鼠模型(hfd,hfd+stz组)。4周后,以空腹血糖值≥16.7mmol/l作为糖尿病模型建模成功标准。在干预前及干预后,进行体重(bodywight,bw)、空腹血糖(fastingbloodglucose,fbg)、血浆甘油三脂(triglyceride,tg)、胆固醇(cholesterol,cho)、血清胰岛素(fastinginsulinlevels,fins)、lee氏指数以及稳态模型胰岛素抵抗指数(homeostasismodelofassessmentforinsulinresistenceindex,homa-ir)等指标的测定。采用免疫荧光检测pvn中npy和可卡因-苯丙胺转录调节肽(cocaine-andamphetamineregulatedtranscript,cart)的表达,western-blotting测定脂肪组织pi3k/akt/gsk3信号通路以及npyy5受体表达变化。2.2观察慢病毒对下丘脑pvn神经细胞的稳定感染向大鼠pvn内精确注射携带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)荧光标记的慢病毒颗粒,分别在病毒注射后1周、2周及4周,使用激光共聚焦观察大鼠脑内慢病毒注射位置、病毒颗粒感染以及荧光蛋白表达情况。2.3分析pvn内npy与大鼠外周胰岛素抵抗的关系并探讨其机制构建重组npy荧光慢病毒颗粒,并使用该病毒进行大鼠pvn核团原位注射,结合hfd干预8周。观察慢病毒颗粒局部感染及npy蛋白过表达水平,检测hfd及npy过表达对大鼠体重、体温、每日摄食量、tg、cho、脂肪组织相对重量、lee氏指数的影响。通过测定大鼠fbg、fins、糖化血红蛋白(glycatedhemoglobina1c,hba1c)、葡萄糖钳夹实验葡萄糖平均输注率(glucoseinfusionrate,gir)、homa-ir、静脉葡萄糖耐量实验(intravenousglucosetolerancetest,ivgtt)以及组织葡萄糖利用指数(glucoseutilizationindex,rg)评估是否存在脂肪组织胰岛素抵抗。并使用western-blotting测定脂肪组织pi3k/akt/gsk3信号通路以及npyy5受体表达变化。2.4探讨npy对3t3-l1脂肪细胞葡萄糖代谢的影响及机制诱导分化3t3-l1脂肪细胞,并采用油红o和pcr对其进行鉴定。npy联合npyy1/y5特异性受体干预分化成熟的3t3-l1脂肪细胞,研究其对脂肪细胞葡萄糖消耗及摄取的影响,分析可能参与的受体,并使用western-blotting测定药物干预后pi3k/akt/gsk3信号通路及npyy5受体表达变化。3.结果:3.1肥胖及糖尿病大鼠pvn内npy蛋白表达增加hfd大鼠bw、fbg、cho、tc及fins水平明显高于lfd。lee氏指数结果显示hfd诱导大鼠肥胖模型成立。hfd及hfd联合stz诱导糖尿病建模均可明显升高大鼠homa-ir,提示大鼠存在一定程度的胰岛素抵抗。免疫组化结果表明,pvn内npy和cart存在一定程度的共表达,肥胖大鼠下丘脑神经细胞内npy和cart蛋白表达水平明显高于低脂饮食(lowfatdiet,lfd)组,在此基础上,糖尿病大鼠较单纯肥胖大鼠下丘脑npy和cart蛋白表达水平进一步增加。尽管肥胖及糖尿病大鼠npy和cart蛋白表达水平均显著升高,但以npy蛋白表达增加为主。3.2慢病毒颗粒原位长期稳定感染外源性注射含gfp的慢病毒载体颗粒可感染神经细胞,gfp广泛表达于神经细胞胞浆中,并在神经树突、轴突中均有分布,神经细胞之间突触联系紧密,形成复杂而精细的神经3d网络。分别对病毒注射后1、2、4周的大鼠大脑进行解剖发现,gfp表达稳定且持久,即使在注射病毒后4周仍可见明显的gfp蛋白在pvn局部高表达。3.3npy过表达诱导大鼠外周胰岛素抵抗3.3.1pvn局部npy持续高表达注射慢病毒8周后,检测大鼠pvn荧光蛋白表达情况发现:1、无论是荧光标记蛋白(cherry)或是npy蛋白在pvn核团均有明显的表达,且npy和cherry表达具有共定位。2、无论是lfd或是hfd组,重组npy慢病毒注射入大鼠pvn均可使局部npy蛋白表达明显增加。这些结果表明,本研究成功地将慢病毒准确注射进入pvn,并使其局部持续高表达8周。3.3.2npy过表达诱导大鼠胰岛素抵抗正常血糖-高胰岛素钳夹实验结果显示hfd、lfd+npy和hfd+npy组gir60-120明显低于lfd,提示无论hfd或pvn局部长期过量表达npy均可诱导外周胰岛素抵抗。然而,本研究并未观察到npy对血浆葡萄糖水平的影响。静脉葡萄糖耐量试验(ivgtt)检测发现,与lfd组相比,hfd、lfd+npy和hfd+npy组血浆胰岛素曲线下面积显著升高,这一变化趋势与葡萄糖钳夹实验结果一致,均提示hfd和npy持续过表达诱导外周组织胰岛素抵抗。此外,homa-ir结果也证实了这一点。3.3.3npy过表达诱导肥胖和脂肪组织胰岛素抵抗hfd、lfd+npy和hfd+npy组体重明显大于lfd组,尤其是在实验后期。值得注意的是,lfd+npy和hfd+npy组大鼠每日摄食量在实验最初阶段(前三周)明显高于lfd和hfd组,但在实验第4周npy诱导进食增加的作用不再明显,npy过表达两组大鼠每日进食量与其余两组无明显差异。npy过表达未能显著改变血糖化血红蛋白、甘油三酯和胆固醇水平,但hfd却增加了三者的血浆水平。这一发现与hfd增加空腹血糖水平一致。另一方面,hfd和pvn内npy过表达使得大鼠脂肪组织相对重量(总脂肪组织/体重)明显增加,这与lee氏指数结果一致,均表明高脂和npy过表达导致肥胖。上述研究结果表明,hfd和npy过表达均可引起肥胖,但后者并不增加血浆葡萄糖、糖化血红蛋白及血脂水平。本研究还检测了组织葡萄糖利用指数(rg’)用于评估不同组织对葡萄糖摄取的影响。结果表明,hfd、lfd+npy和hfd+npy组脂肪组织2-[3h]dg摄取明显降低,而各组肌肉组织2-[3h]dg摄取明显差异。3.3.4npy调节pi3k/akt/gsk信号通路和y5受体表达相比于lfd组,hfd、lfd+npy和hfd+npy组脂肪组织pi3k蛋白水平轻度降低,但akt,gsk3β和gsk3α蛋白水平无明显变化。然而,pvn内npy长期过表达显著减少gsk3β、pi3k和akt磷酸化,且与饮食无关。此外,相比于lfd组,hfd、lfd+npy和hfd+npy组脂肪组织gsk3α的磷酸化水平显著降低,而y5受体水平显著升高。3.4npy对3t3-l1脂肪细胞葡萄糖代谢的影响及机制3.4.1成功诱导分化3t3-l1脂肪细胞油红o染色及pcr鉴定证实诱导分化的3t3-l1脂肪细胞呈现成熟脂肪细胞特性。3.4.2npy经由y5受体抑制脂肪细胞葡萄糖消耗和2-[3h]dg摄取npy可以直接减少在3t3-l1脂肪细胞的葡萄糖消耗。高剂量npy降低基础葡萄糖消耗,而较低剂量npy未能影响在3t3-l1脂肪细胞基础葡萄糖消耗。此外,npy可以抑制胰岛素刺激的葡萄糖消耗。采用特异性受体抑制剂预处理细胞后发现,npyy5受体拮抗剂(l-152,804)明显逆转npy对胰岛素刺激葡萄糖消耗的抑制作用,但y1受体拮抗剂(bibp-3226)无此作用。2-[3h]dg摄取实验亦表明,npyy5受体拮抗剂可改善npy对脂肪细胞2-[3h]dg摄取的抑制作用,但y1受体拮抗剂无此作用,这表明npy抑制脂肪细胞葡萄糖摄取及消耗,且y5受体可能是介导该作用的主要受体。3.4.3npy通过y5受体调节3t3-l1脂肪细胞pi3k-akt和gsk信号通路npy明显抑制3t3-l1脂肪细胞gsk3α、gsk3β、pi3k和akt磷酸化,但并不影响akt、pi3k、gsk3α和gsk3β总蛋白表达水平。npyy5受体拮抗剂可以逆转npy对上述信号通路分子磷酸化的抑制作用,但npyy1受体拮抗剂无此作用,提示npy主要通过Y5受体调节3T3-L1脂肪细胞PI3K-Akt和GSK信号通路。4.结论:4.1 HFD诱导的肥胖模型以及HFD联合STZ注射诱导的糖尿病大鼠模型均存在胰岛素抵抗。PVN内NPY和CART存在一定程度的共表达,肥胖大鼠PVN内NPY和CART蛋白表达明显增加,在此基础上,糖尿病大鼠PVN内NPY和CART蛋白表达进一步增加,且以NPY蛋白增加为主。4.2外源性注射含GFP慢病毒载体颗粒可有效感染神经细胞,GFP广泛表达于神经细胞胞浆中。GFP表达稳定且持久,即使在注射病毒后4周仍可见明显的GFP蛋白在PVN局部高表达。4.3 PVN局部NPY长期过表达促进饮食短暂性增加,并诱导外周脂肪组织胰岛素抵抗,但并不改变血糖、糖化血红蛋白及血脂水平。此外,NPY过表达可明显降低大鼠脂肪组织GSK3β、PI3Kp85及Akt磷酸化水平,同时增加Y5 R受体表达。4.4 NPY可明显抑制胰岛素刺激的葡萄糖消耗及摄取,NPY Y5受体拮抗剂(L-152,804)逆转NPY对胰岛素刺激葡萄糖消耗及摄取的抑制作用,而Y1受体拮抗剂无此作用。NPY明显抑制3T3-L1脂肪细胞GSK3α、GSK3β、PI3K和Akt磷酸化,NPY Y5受体拮抗剂可以逆转NPY对上述信号通路分子磷酸化的抑制作用,提示NPY通过Y5受体诱导外周脂肪组织胰岛素抵抗。