研究背景胆汁淤积指肝内外各种原因造成胆汁形成和(或)排泄障碍,反流入血液的所引起一系列临床症状及肝损伤的临床综合症,可进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝衰竭。根据胆汁淤积的发生部位可将其分为肝内和肝外胆汁淤积两大类,肝内胆汁淤积疾病主要有病毒性肝炎、酒精或非酒精性脂肪性肝炎、药物性肝损伤、妊娠肝内胆汁淤积、各种病因导致肝硬化、原发性胆汁性肝硬化/原发性硬化性胆管炎、原发性硬化性胆管炎及合并自身免疫性肝炎、药物性胆管病等;肝外胆汁淤积主要疾病和病因有胆管结石、先天性肝外胆管闭锁、胆总管/Oddi括约肌狭窄、胆管寄生虫病、胆总管囊肿、胆管及周围组织肿瘤压迫、胰腺癌、胰腺囊肿和慢性胰腺炎等。胆汁淤积使引起毒性胆汁代谢物质蓄积于肝内,出现胆汁淤积性病变,在多种细胞因子持续刺激下,肝实质细胞进一步受损,可发展为肝组织纤维化。肝纤维化主要病理改变为肝组织内细胞外基质的过度沉积,炎症反应是其重要机制之,在炎症因子作用下,纤维化介质与肝星状细胞膜上受体结合,实现肝星状细胞活化、增殖、转型,促进胶原、糖蛋白的合成,从而重构细胞外基质,导致肝纤维化,各种纤维化介质对细胞外基质的代谢有重要的调节作用,尤其是转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF—β1)、肿瘤坏死因子-α、血小板源生长因子以及IL-6等,在促进细胞的增殖、迁移和转化过程中起重要作用,同时激活的肝星状细胞释放活性氧类物质而反过来继续激活肝星状细胞以促进纤维化的发展。TGF—β1被认为是最强的促肝纤维化因子,在促肝纤维化中占关键地位,其纤维化作用为对细胞外基质的形成产生一定的刺激作用,降低细胞外基质蛋白酶的活化,胶原酶的活性,减少其降解,使成纤维细胞发生趋化作用,从而促进诱发组织器官逐渐发生纤维化,目前研究认为,TGF—β1主要通过TGF/Smad信号转导通路来发挥促纤维化的作用。Smads蛋白是目前所知的唯一TGF-β受体的胞内激酶底物,是TGF-β信号跨细胞膜传入细胞核内的关键下游蛋白,调节核内靶基因的转录,从而发挥TGF-β1的生物效应。八宝丹是我国治疗肝胆系疾病的重要中成药,具有清利湿热,活血解毒,去黄止痛的功效,近年来已有多项研究发现,八宝丹可保护肝脏细胞,降低血清肝功能、肝纤维化指标水平,改善黄疽,且不良反应较少,在临床上广泛应用于防治传染性病毒性肝炎、肝硬化等肝胆系疾病。进一步研究发现八宝丹可以改善肝纤维化大鼠的炎症反应及变性坏死,逆转肝纤维化,其抗纤维化机制尚未明确,是否通过影响转化生长因子β1实现肝纤维的逆转尚未有研究。Masson染色法利用胶原纤维含有碱性氨基酸,能与酸性染料进行结合而着色的特点对胶原纤维着色,光镜下胶原纤维呈亮蓝色或绿色,已有学者发现在Masson染色的作用下,慢性肝炎患者肝组织汇管区周围的Ⅰ型胶原蛋白比HE染色可更清晰的显示,进一步准确展示出慢性肝炎发展至肝纤维化的进程,可直观判定肝纤维化程度与范围。目前认为,肝脏纤维化主要与Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维有关,运用苦味酸-天狼星红染色法(Picric Sirius red,PSR),在偏振光法显微镜下能够在一张切片上对不同类型的胶原纤维定性及定量诊断,明确胶原纤维的种类及分布,可早期及时诊断肝组织纤维化病理状态,如:Ⅰ型胶原表现为橘黄色或红色,镜下可见其纤维排列紧密,具有很强的双折光性;Ⅲ型胶原纤维为绿色的细纤维,为疏松网状结构,具有较弱的双折光性。作为常用的两种方法,其在评价肝脏纤维化方面的比较尚未见报道。故本研究以ANIT诱导小鼠建立胆汁淤积性肝病模型,应用上述两种不同的染色方法观察胶原沉积情况,初步比较苦味酸-天狼猩红染色法和Masson染色法两种方法在评价肝纤维化中的应用价值,并以八宝丹治疗,探讨其对胆汁淤积症小鼠的保护作用,通过免疫组织化学、RT-PCR研究TGF/Smad在小鼠肝组织中的表达情况,探讨八宝丹对TGF/Smad信号转导通路的影响,阐明其作用机制。目的观察八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及探讨其可能机制,为八宝丹治疗胆汁淤积性肝病提供理论依据。方法将15只昆明种雄性小鼠随机分为3组:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组,每组5只。除空白对照组小鼠外,其余两组小鼠均一次性予灌胃1%α—萘异硫氰酸酯(α-Naphthyl isothiocyanate,ANIT)橄榄油溶液,按照 100mg/Kg剂量建立胆汁淤积模型。空白对照组每日予生理盐水灌胃1次,胆汁淤积组每日予生理盐水灌胃1次,八宝丹治疗组每日予八宝丹生理盐水混悬液灌胃1次。给药10d后麻醉后取血及肝组织。检测各组小鼠血清中总胆汁酸(total bile acids,TBA)、总胆红素(total bilirubin,TBil)、直接胆红素(direct bilirubin,DBil)、谷氨酸氨基转移酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)、碱性憐酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷氨酰转肽酶(丫-glutamyl transpeptidase,GGT)、白蛋白(albumin,ALB)、透明质酸(hyaluronic acid,HA),层粘连蛋白(laminin,LN),Ⅲ型前胶原(type Ⅲ procollagen,PC-Ⅲ),Ⅳ型胶原(type Ⅳ collagen,C-Ⅳ)水平。肝组织采用苏木素-伊红染色(Hematoxylin and eosin,HE染色)、Masoon染色、苦味酸-天狼星红染色法观察其病理形态学改变;免疫组织化学法检测肝组织TGF-β1、Smad3蛋白表达;RT-PCR 检测肝组织 TGF-β1、Smad3 mRNA 表达。结果血清学指标(1)肝功能指标:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:ALT(42.44±4.93vs400.33±65.49 vs 144.16±38.66)、AST(171.09±22.30 vs 656.95±118.17 vs 315.81±75.65)、TBIL(6.31±0.91 vs 53.12±7.51vs 19.42±1.81)、DBIL(4.54±0.86 vs 48.49±7.08 vs 14.26±2.07)、ALP(158.82±39.18 vs 953.64±282.86 vs 535.99±131.42)、GGT(29.58±3.49 vs 159.49±24.78 vs 81.53±13.59)、TBA(39.01±3.05vs 339.47±167.73 vs 238.28±103.87),各组间差异有统计学意义,P<0.01;ALB(30.77±2.24 vs 22.47±2.03 vs 25.14±2.38),空白对照组与胆汁淤积组之间有统计学差异P<0.01,八宝丹治疗组与胆汁淤积组之间无统计学差异,P>0.01。(2)肝纤维化指标:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:HA(302.16±45.95vs 644.21±71.69 vs 443.79±47.06)、LN(135.13±49.31vs417.55±37.76 vs224.33±48.61)、PC-Ⅲ(12.15±1.87vs 24.94±2.02vs 16.15±1.03)、C-Ⅳ(37.12±2.00 vs74.98±4.34vs 54.92±4.44),各组间差异有统计学意义,P<0.01。肝脏组织学(1)HE染色:空白对照组肝组织结构基本正常,肝细胞呈整齐排列;胆汁淤积组肝细胞大面积坏死,肝小叶结构大多破坏。八宝丹治疗组肝细胞形态结构较清晰,肝损伤明显改善,肝坏死面积减少。(2)Masoon染色:空白对照组可见少量胶原纤维。胆汁淤积组肝组织内大量蓝色胶原纤维沉积,已形成假小叶。八宝丹治疗组胶原纤维介于空白对照组及胆汁淤积组之间。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组纤维化面积(6.18±0.98vs39.37±3.89vs25.65±2.24),各组间差异有统计学意义,P<0.01。(3)苦味酸-天狼星红染色:空白对照组小鼠肝组织少量Ⅰ、Ⅲ型胶原显色。胆汁淤积组:肝组织中可见明显增多的橘红色Ⅰ型胶原粗纤维,形成小叶间分隔,Ⅲ型胶原增多。八宝丹治疗组主要为绿色细丝纤维的Ⅲ型胶原增多,Ⅰ型胶原较胆汁淤积组少。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组纤维化面积(5.56±0.61vs38.21±3.28vs20.65±2.01),各组间差异有统计学意义,P<0.01。免疫组化结果显示TGF—β1、Smad3蛋白在空白对照组肝组织中基本无阳性表达,胆汁淤积组表达显著增强,八宝丹治疗组阳性颗粒明显减少,染色程度减轻。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:TGF—β1蛋白(0.95±0.21 vs6.52±1.01vs4.17±0.72);Smad3 蛋白(1.05±0.52vs6.89±1.29vs4.85±0.93),各组间差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR结果显示TGF—β1、Smad3 mRNA在空白对照组肝组织表达较少,胆汁淤积组表达显著增多,八宝丹治疗组表达升高。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:TGF—β1 mRNA(0.44±0.05vs1.00±0.06vs0.66±0.02);Smad3 mRNA(0.63±0.04vs0.93±0.05vs0.79±0.03),各组间差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.八宝丹可以降低ANIT诱导的胆汁淤积肝病小鼠血清中肝功能(TBA、TBil、DBil、ALT、AST、ALP、GGT)、肝纤维化指标(HA、LN、PC-Ⅲ C-Ⅳ)水平,减轻肝细胞病变及坏死,对胆汁淤积症有积极的治疗作用;减少肝胶原纤维沉积,预防肝纤维化。2.八宝丹可显著抑制的TGF—β1、Smad3 mRNA及蛋白的表达,抑制TGF-β1/Smad信号通路激活,与八宝丹的护肝作用有关。3.采用组织学染色法与HE染色评价肝纤维化程度,可同时明确当前肝脏损伤情况及肝纤维化程度。对比Masson染色法,苦味酸-天狼猩红染色对胶原纤维有更好的特异性,结果明显,利于分型,是一种较好的胶原纤维染色方法,具有更大的优势。