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艾滋病（AIDS）是主要由1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的恶性传染性疾病。目前，联合抗逆转录病毒疗法(cART)是治疗艾滋病的最有效方法。然而，HIV-1基因组具有高度的变异性，耐药突变株的出现限制了cART的功效。因此，研发具有新结构、新机制的HIV-1抑制剂非常必要。
HIV-1核衣壳蛋白7(NCp7)是由55个氨基酸残基组成的短肽，并具有2个锌指中心结构域。NCp7在HIV-1逆转录和整合的过程中发挥至关重要的作用，NCp7的结构发生改变或因药物作用发生交联，HIV-1复制周期就会受到影响，致使不完整的病毒出芽，释放出低感染力或无感染力的病毒。通过对NCp7的核苷酸序列进行突变试验，结果证明NCp7具有高度的保守性，任意氨基酸的改变都将使其失活。因此，针对NCp7的抑制剂不易由于HIV-1的基因突变而产生耐药性。所以NCp7成为近年来抗艾滋病药物研究备受关注的新靶点之一。
基于NCp7在HIV-1生命周期中的作用机制以及其空间结构特征，目前已有大量针对该靶点抑制剂被报道。根据作用机制的不同主要分两种:(1)基于干扰NCp7与核酸结合的抑制剂;(2)基于锌离子“逐出”机制的抑制剂。其中基于锌离子“逐出”机制的抑制剂S-酰基-2-巯基苯甲酰胺硫酯(SAMT)可以通过亲核作用使NCp7的锌指结构发生改变并逐出锌离子，使NCp7失活。在发挥作用之后，SAMT转化得到2-巯基苯甲酰胺硫酯(MT)，MT在细胞内乙酰辅酶A的作用下，乙酰化得到SAMT再次发挥作用。通过循环往复利用，提高了药物的半衰期，减少了使用量，因此SAMT与MT是具有良好前景的先导化合物。然而，与大多数用于治疗HIV-1感染的药物相比，SAMT和MT的抗HIV-1活性相对较弱。同时SAMT中的硫酯键极易水解，很难配制成治疗产品，因此，通常针对抑制剂MT进行修饰。但由于MT结构中存在巯基，使其具有极性较大、跨膜性差、容易被氧化、毒性较大等缺陷，因此使用前药修饰策略来改善其存在的缺陷、提高其抗病毒活性是当前研究的热点。
前药修饰策略在抗病毒药物研究领域有着广泛的应用，通过前药修饰可以克服先导化合物在吸收、分布、代谢、排泄以及毒性(ADMET)上的不足，提高成药性。除此之外，双靶点前药还可以使所得化合物兼具两种母体药物的优势，发挥“1+1=2，甚至＞2”的功效，是发现抗耐药性抗病毒药物的重要策略。
本论文围绕改善NCp7抑制剂MT抗HIV-1活性不佳、存在巯基使其成药性较差的科学问题，利用前药策略对其进行修饰，主要分为以下两部分:
第一部分:MT与逆转录酶抑制剂双靶点前药的设计、合成及活性评价
HIV-1逆转录酶(RT)在病毒生命周期中起着至关重要的作用，且人体内没有其同源酶，因此成为抗艾滋病药物研究的重要靶点之一。目前，美国FDA共批准14个逆转录酶抑制剂（化学实体）上市用于艾滋病的治疗，根据作用机理的不同分为核苷（酸）类逆转录酶抑制剂(NRTIs/NtRTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)。逆转录酶抑制剂具有高效、低毒可与其他药物联用的特性，在cART疗法中占据十分重要的地位。但由于HIV-1具有高度变异性，在逆转录酶抑制剂药物选择压力下，极容易产生基因突变而产生（交叉）耐药性。因此，研发具有高效抗耐药性的HIV-1抑制剂依然十分必要。
与之相反，NCp7具有高度的保守性，针对NCp7的抑制剂不易由于HIV-1基因突变产生耐药性。又因为NCp7在发挥生物学功能时常与逆转录酶形成蛋白复合物，因此本部分研究基于双靶点前药的修饰策略，选取具有高选择性和耐药性的NCp7抑制剂——2-巯基苯甲酰胺硫酯(MT)，通过在体内可以自发水解的酯键与逆转录酶抑制剂相连，设计合成两类双靶点前药。期望所设计的目标化合物能兼具两种母体药物的优势，既具有优秀的抗HIV-1野生株活性也具有优秀的抗耐药性。根据已上市的逆转录酶抑制剂的种类，本部分设计合成了两大类MT双前药化合物，即:与NRTI的双靶点前药（5个）、与NNRTI的双靶点前药（6个）。并且对目标化合物进行了不同细胞系中不同HIV病毒株的细胞水平活性测试，进而选取代表化合物进行了血浆稳定性代谢测试。
结果表明:通过双靶点前药修饰，MT与NRTI的双靶点前药所有目标化合物的抗HIV活性相对于母体药物MT均有大幅度提高，并且linker长度越长或分支数越少的化合物表现出更强的抗病毒活性。该系列化合物中SSK1-3在MT4细胞系和TZM-b1细胞系中均表现出最佳的抗HIV活性，其抑制HIV-1不同毒株的EC50值分别为0.042μM(ⅢB)、1.329μM(RES056)和0.308μM(NL4-3)，分别是母体药物MT的125倍、6倍和8倍。SSK1-3血浆稳定性测试结果表明:其在血浆中代谢比较充分，母药MT的释放成良好的线性，具有前药特性。但是其在血浆中代谢速度过快，10分钟之内几乎完全降解，可能会影响其到达靶细胞发挥作用，还需要针对其血浆稳定性进行进一步的修饰。MT与NNRTI双靶点前药的活性测试正在进行中。
第二部分:基于智能化降解的MT二硫键前药的设计、合成及活性评价
二硫键（S-S键）是一种重要的化学官能团，主要存在于各类天然小分子化合物和生物体蛋白质结构中。二硫键在体内可以被广泛存在于体液和细胞质中的谷胱甘肽(GSH)还原断裂，且细胞内GSH的浓度是血浆中的2000-4000倍，因此含有二硫键的药物通常在血浆中较为稳定，而进入细胞后在较高GSH浓度下发生还原裂解。
针对MT酯键前药存在的血浆稳定性不佳的问题，我们基于二硫键独特的氧化还原特性，设计合成了一系列MT二硫键前药，期望该系列化合物能在血浆中稳定存在，而进入细胞后裂解释放出母体药物发挥抗病毒作用。同时对于MT的巯基进行修饰，改善因其存在巯基而使化合物具有成药性不佳的缺陷。本部分研究，我们共设计合成了7个MT二硫键前药并对其进行了细胞水平的抗病毒活性测试，同时选取代表化合物进行了血浆稳定性和GSH代谢稳定性测试。
实验结果表明:通过二硫键前药修饰，新合成的大部分目标化合物对HIV-1野生(ⅢB)毒株、HIV-2(ROD)毒株的抑制活性均高于母体药物MT。其中SSK2-3抑制HIV-1野生株的活性最佳（ECso=2.38μM），优于先导化合物MT(EC50=5.52μM)2.3倍，SSK2-2对于HIV-2毒株表现出最佳的抑制活性(EC50=1.27μM)，是先导化合物MT（EC50=5.37μM）4.2倍。但是，二硫键前药系列化合物的细胞毒性和选择性指数与母体药物MT相比结果较差，仍需进一步修饰改善。我们选取该系列代表化合物SSK2-3研究其血浆稳定性及GSH稳定性。结果表明:SSK2-3在血浆中稳定存在，120分钟内几乎不分解;而在人体细胞GSH浓度下(5mM)，SSK2-3能快速发生代谢降解，降解的半衰期为192分钟，且在60分钟内几乎分解释放出原药发挥作用，体现出二硫键前药智能化降解的优势。
总之，本文以2-巯基苯甲酰胺硫酯(MT)为先导化合物，基于前药设计策略，先后设计合成了两个系列共计18个MT前药。生物学评价结果显示，多种化合物具有较高的HIV抑制活性，明显优于MT，可作为先导化合物供进一步研究。同时，本论文获得的初步构效关系及成药性数据为下一步结构优化提供了有价值的信息。
HIV-1核衣壳蛋白7(NCp7)是由55个氨基酸残基组成的短肽，并具有2个锌指中心结构域。NCp7在HIV-1逆转录和整合的过程中发挥至关重要的作用，NCp7的结构发生改变或因药物作用发生交联，HIV-1复制周期就会受到影响，致使不完整的病毒出芽，释放出低感染力或无感染力的病毒。通过对NCp7的核苷酸序列进行突变试验，结果证明NCp7具有高度的保守性，任意氨基酸的改变都将使其失活。因此，针对NCp7的抑制剂不易由于HIV-1的基因突变而产生耐药性。所以NCp7成为近年来抗艾滋病药物研究备受关注的新靶点之一。
基于NCp7在HIV-1生命周期中的作用机制以及其空间结构特征，目前已有大量针对该靶点抑制剂被报道。根据作用机制的不同主要分两种:(1)基于干扰NCp7与核酸结合的抑制剂;(2)基于锌离子“逐出”机制的抑制剂。其中基于锌离子“逐出”机制的抑制剂S-酰基-2-巯基苯甲酰胺硫酯(SAMT)可以通过亲核作用使NCp7的锌指结构发生改变并逐出锌离子，使NCp7失活。在发挥作用之后，SAMT转化得到2-巯基苯甲酰胺硫酯(MT)，MT在细胞内乙酰辅酶A的作用下，乙酰化得到SAMT再次发挥作用。通过循环往复利用，提高了药物的半衰期，减少了使用量，因此SAMT与MT是具有良好前景的先导化合物。然而，与大多数用于治疗HIV-1感染的药物相比，SAMT和MT的抗HIV-1活性相对较弱。同时SAMT中的硫酯键极易水解，很难配制成治疗产品，因此，通常针对抑制剂MT进行修饰。但由于MT结构中存在巯基，使其具有极性较大、跨膜性差、容易被氧化、毒性较大等缺陷，因此使用前药修饰策略来改善其存在的缺陷、提高其抗病毒活性是当前研究的热点。
前药修饰策略在抗病毒药物研究领域有着广泛的应用，通过前药修饰可以克服先导化合物在吸收、分布、代谢、排泄以及毒性(ADMET)上的不足，提高成药性。除此之外，双靶点前药还可以使所得化合物兼具两种母体药物的优势，发挥“1+1=2，甚至＞2”的功效，是发现抗耐药性抗病毒药物的重要策略。
本论文围绕改善NCp7抑制剂MT抗HIV-1活性不佳、存在巯基使其成药性较差的科学问题，利用前药策略对其进行修饰，主要分为以下两部分:
第一部分:MT与逆转录酶抑制剂双靶点前药的设计、合成及活性评价
HIV-1逆转录酶(RT)在病毒生命周期中起着至关重要的作用，且人体内没有其同源酶，因此成为抗艾滋病药物研究的重要靶点之一。目前，美国FDA共批准14个逆转录酶抑制剂（化学实体）上市用于艾滋病的治疗，根据作用机理的不同分为核苷（酸）类逆转录酶抑制剂(NRTIs/NtRTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)。逆转录酶抑制剂具有高效、低毒可与其他药物联用的特性，在cART疗法中占据十分重要的地位。但由于HIV-1具有高度变异性，在逆转录酶抑制剂药物选择压力下，极容易产生基因突变而产生（交叉）耐药性。因此，研发具有高效抗耐药性的HIV-1抑制剂依然十分必要。
与之相反，NCp7具有高度的保守性，针对NCp7的抑制剂不易由于HIV-1基因突变产生耐药性。又因为NCp7在发挥生物学功能时常与逆转录酶形成蛋白复合物，因此本部分研究基于双靶点前药的修饰策略，选取具有高选择性和耐药性的NCp7抑制剂——2-巯基苯甲酰胺硫酯(MT)，通过在体内可以自发水解的酯键与逆转录酶抑制剂相连，设计合成两类双靶点前药。期望所设计的目标化合物能兼具两种母体药物的优势，既具有优秀的抗HIV-1野生株活性也具有优秀的抗耐药性。根据已上市的逆转录酶抑制剂的种类，本部分设计合成了两大类MT双前药化合物，即:与NRTI的双靶点前药（5个）、与NNRTI的双靶点前药（6个）。并且对目标化合物进行了不同细胞系中不同HIV病毒株的细胞水平活性测试，进而选取代表化合物进行了血浆稳定性代谢测试。
结果表明:通过双靶点前药修饰，MT与NRTI的双靶点前药所有目标化合物的抗HIV活性相对于母体药物MT均有大幅度提高，并且linker长度越长或分支数越少的化合物表现出更强的抗病毒活性。该系列化合物中SSK1-3在MT4细胞系和TZM-b1细胞系中均表现出最佳的抗HIV活性，其抑制HIV-1不同毒株的EC50值分别为0.042μM(ⅢB)、1.329μM(RES056)和0.308μM(NL4-3)，分别是母体药物MT的125倍、6倍和8倍。SSK1-3血浆稳定性测试结果表明:其在血浆中代谢比较充分，母药MT的释放成良好的线性，具有前药特性。但是其在血浆中代谢速度过快，10分钟之内几乎完全降解，可能会影响其到达靶细胞发挥作用，还需要针对其血浆稳定性进行进一步的修饰。MT与NNRTI双靶点前药的活性测试正在进行中。
第二部分:基于智能化降解的MT二硫键前药的设计、合成及活性评价
二硫键（S-S键）是一种重要的化学官能团，主要存在于各类天然小分子化合物和生物体蛋白质结构中。二硫键在体内可以被广泛存在于体液和细胞质中的谷胱甘肽(GSH)还原断裂，且细胞内GSH的浓度是血浆中的2000-4000倍，因此含有二硫键的药物通常在血浆中较为稳定，而进入细胞后在较高GSH浓度下发生还原裂解。
针对MT酯键前药存在的血浆稳定性不佳的问题，我们基于二硫键独特的氧化还原特性，设计合成了一系列MT二硫键前药，期望该系列化合物能在血浆中稳定存在，而进入细胞后裂解释放出母体药物发挥抗病毒作用。同时对于MT的巯基进行修饰，改善因其存在巯基而使化合物具有成药性不佳的缺陷。本部分研究，我们共设计合成了7个MT二硫键前药并对其进行了细胞水平的抗病毒活性测试，同时选取代表化合物进行了血浆稳定性和GSH代谢稳定性测试。
实验结果表明:通过二硫键前药修饰，新合成的大部分目标化合物对HIV-1野生(ⅢB)毒株、HIV-2(ROD)毒株的抑制活性均高于母体药物MT。其中SSK2-3抑制HIV-1野生株的活性最佳（ECso=2.38μM），优于先导化合物MT(EC50=5.52μM)2.3倍，SSK2-2对于HIV-2毒株表现出最佳的抑制活性(EC50=1.27μM)，是先导化合物MT（EC50=5.37μM）4.2倍。但是，二硫键前药系列化合物的细胞毒性和选择性指数与母体药物MT相比结果较差，仍需进一步修饰改善。我们选取该系列代表化合物SSK2-3研究其血浆稳定性及GSH稳定性。结果表明:SSK2-3在血浆中稳定存在，120分钟内几乎不分解;而在人体细胞GSH浓度下(5mM)，SSK2-3能快速发生代谢降解，降解的半衰期为192分钟，且在60分钟内几乎分解释放出原药发挥作用，体现出二硫键前药智能化降解的优势。
总之，本文以2-巯基苯甲酰胺硫酯(MT)为先导化合物，基于前药设计策略，先后设计合成了两个系列共计18个MT前药。生物学评价结果显示，多种化合物具有较高的HIV抑制活性，明显优于MT，可作为先导化合物供进一步研究。同时，本论文获得的初步构效关系及成药性数据为下一步结构优化提供了有价值的信息。