肿瘤细胞要实现其扩散、转移,必须首先穿越由细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)组成的屏障。该屏障主要由两种成分构成:一是结构蛋白;二是糖氨聚糖,其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparin sulphate proteoglycan,HSPG)。乙酰肝素酶(heparanse,Hpa)是一种蛋白聚糖类碳水化合物,是基底膜的主要构成成分,它能与细胞表面及ECM中的活性分子结合,粘附于细胞表面,是ECM聚集和稳定的基础。同时,Hpa是体内唯一能够降解HSPG的内切酶,通过降解肿瘤细胞外基质、基底膜和促进新生血管形成来加速肿瘤的扩散和转移。Hpa主要通过直接、间接两种方式发挥促血管生成作用:①直接作用,Hpa可直接作用于内皮细胞以生芽方式促进血管生成;②间接作用,通过血管内皮细胞释放乙酰硫酸肝素盐—碱性成纤维细胞生长因子(HS-bFGF)复合物和产生HS降解片段以促进bFGF活性来间接诱发血管生成反应。bFGF是一种强有力的促血管生成剂,对肿瘤间质血管新生和侵袭起有重要作用。目前国内外关于卵巢癌中Hpa的表达情况与其血管生成及临床预后的研究很少,为此,本实验采用原位杂交及免疫组化技术,研究了Hpa在卵巢癌中的表达及其与卵巢癌中微血管密度(Microvessel density,MVD)、bFGF蛋白表达的相关性,结合卵巢癌的临床病理特征,初步探讨卵巢癌中Hpa及其与其血管生成、预后的关系。为寻找卵巢癌新的诊断和治疗途径提供实验资料。第一部分乙酰肝素酶mRNA及蛋白在卵巢癌中的表达一、材料与方法1.标本来源选取2003年1月-2005年11月在第三军医大学附属西南医院、新桥医院、大坪医院手术切除的卵巢癌组织标本41例(部分为卵巢癌标本蜡块),其中浆液性囊腺癌22例、粘液性囊腺癌10例,其他9例。所有病例均经病理学确诊,手术前均未接受过化疗及放疗。选取同期正常卵巢组织(取自卵巢浆液性囊肿周边的正常卵巢组织)10例作为正常对照。选取第三军医大学附属大坪医院一例恶性黑色素瘤(胆囊)组织作为阳性对照。2.实验指标及方法2.1.原位杂交法检测卵巢癌中Hpa mRNA的表达。2.2.免疫组化S-P法检测同一标本连续切片中Hpa蛋白的表达和10例正常卵巢组织中Hpa蛋白的表达。3.统计学处理:应用x~2检验、方差分析和t检验。二、结果1.Hpa mRNA的表达结果显示,棕黄色的阳性颗粒主要在癌细胞的胞浆内。2.正常卵巢组织中Hpa蛋白在血管内皮细胞的胞浆中表达。卵巢癌组织中Hpa蛋白主要表达在癌细胞的胞浆内,在癌巢周围的血管内皮细胞偶有表达。3.41例卵巢癌中Hpa蛋白阳性33例,阴性8例,阳性率为80.48%。在10例正常卵巢组织中1例呈阳性表达,阳性率为10.00%。Hpa在卵巢癌和正常卵巢组织中的表达有显著性差异(P＜0.05)。4.晚期卵巢癌(Ⅲ-Ⅳ期)中Hpa蛋白表达率及表达强度高于早期卵巢癌(Ⅰ-Ⅱ期)(P＜0.01);低分化组中Hpa蛋白表达率及表达强度高于高-中分化组(P＜0.05);不同组织学类型及年龄组中Hpa蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。三、讨论Hpa是人体内唯一能够降解HSPG的内切酶,在肿瘤细胞的侵袭、转移及血管生成等过程中起着极其重要的作用,是肿瘤细胞扩散与转移过程中的一个关键酶。在人类多种恶性肿瘤中均可检测到Hpa的表达,但其表达率可能有所不同。本实验结果显示,Hpa mRNA与Hpa蛋白的表达具有一致性,棕黄色的阳性颗粒主要在癌细胞的胞浆内;正常卵巢组织中Hpa蛋白阳性率为10.00%,卵巢癌中Hpa蛋白表达阳性率为80.48%,Hpa在卵巢癌组织中的表达高于正常卵巢;本实验结合临床病理参数对Hpa蛋白在卵巢癌中的表达特性进行了分析,发现晚期以及低分化的卵巢癌中Hpa蛋白表达率及强度分别高于早期和高-中分化的卵巢癌,提示Hpa在促进肿瘤的扩散和转移中发挥重要作用。第二部分乙酰肝素酶与卵巢癌血管生成的关系一、材料与方法1.标本来源:同第一部分。2.实验指标及方法:2.1.采用免疫组化S-P法,CD34标记血管内皮细胞,计数MVD。2.2.采用免疫组化S-P法,检测卵巢癌中bFGF蛋白的表达。3.统计学处理:采用t检验、方差分析和相关性分析。二、结果1.CD34标记血管内皮细胞,着色位于血管内皮细胞,呈现棕色或棕黄色颗粒。41例卵巢癌组织中MVD计数11～236,平均值为65.20±63.59。2.卵巢癌组织中Hpa蛋白的表达与MVD成正相关r=0.351(P＜0.05)。3.晚期和低分化癌组中的MVD值分别高于早期和高-中分化癌组(P＜0.05)。4.卵巢癌组织中bFGF阳性28例(28/41),bFGF阳性部位主要在肿瘤细胞胞浆中,bFGF阳性表达组MVD值高于bFGF阴性表达组MVD值(77.01±67.43 vs 39.76±47.17)(P＜0.05)。5.卵巢癌组织中Hpa表达和bFGF表达呈正相关r=0.420(P＜0.05)。6.41例卵巢癌组织中Hpa、bFGF共阳性表达25例。共阳性表达组的MVD值高于其他组的MVD值(82.05±69.43 vs 38.87±43.10)(P＜0.05)。三、讨论恶性肿瘤的无限制侵袭性生长及其转移依赖于血管生成,目前研究表明Hpa的高表达可以明显促进肿瘤组织的血管生成能力,并且认为Hpa通过直接、间接两种方式发挥促血管生成作用:①直接作用,Hpa可直接作用于内皮细胞以生芽方式促进血管生成;②间接作用,通过血管内皮细胞释放HS-bFGF复合物和产生HS降解片段以促进bFGF活性来间接诱发血管生成反应。我们的研究结果显示:33例Hpa蛋白表达阳性的卵巢癌病例中Hpa与MVD成正相关,表明Hpa在卵巢癌中的表达增高,能够促进卵巢癌的血管生成能力;Hpa表达和bFGF表达呈正相关,Hpa、bFGF二者均阳性表达组的MVD值高于其他组的MVD值,表明Hpa有可能通过释放和激活bFGF来促进卵巢癌的血管生成,且二者对肿瘤的血管生成起着协同的作用。第三部分乙酰肝素酶与卵巢癌预后的关系一、材料与方法1.标本来源:同第一部分。2.实验指标及方法:2.1.免疫组化检测,方法及结果同第一、二部分。2.2.临床随访。3.统计学处理:采用Kaplan-Meier法,log-rank法。二、结果收集病例41例均经电话随访,其中4例失访。年龄29-73岁,平均50±10岁。随访时间截止到2005年12月,平均生存时间为389.73±218.11天,最长随访时间为1081天,最短90天。采用Kaplan-Meier法计算平均生存时间,Hpa表达阳性组的平均生存时间为583.97±77.19天,Hpa表达阴性组为682.33±100.97天,二者比较无显著性差异(P=0.171)。三、讨论在人类多种恶性肿瘤中均可检测到Hpa的表达,并且已经发现Hpa是膀胱癌、胰腺癌和胃癌的重要预后因素,Hpa是否可以作为卵巢癌的独立预后因素呢?我们对41例卵巢癌病例进行了随访(其中4例失访),Kaplan-Meier法计算平均生存时间,Hpa表达阳性组的平均生存时间为583.97±77.19天,Hpa表达阴性组为682.33±100.97天,二者比较无显著性差异,该结果可能与研究例数少,随访时间短有关系。从Kaplan-Meier生存曲线可以看到随着随访时间的延长Hpa表达阳性组的生存曲线较Hpa表达阴性组有更明显的下降趋势,如果增加样本量、延长随访时间,有可能发现Hpa表达阳性组的生存时间低于Hpa表达阴性组。结论1.采用原位杂交及免疫组化技术,发现Hpa在卵巢癌中表达增高,晚期以及低分化的卵巢癌中的Hpa蛋白阳性表达率及表达强度分别高于早期和高-中分化的卵巢癌组织,提示Hpa在促进肿瘤穿透细胞外基质和基底膜结构,实现肿瘤的扩散和转移中发挥重要作用。2.卵巢癌病例中Hpa蛋白的表达与MVD成正相关;Hpa表达和bFGF表达呈正相关;Hpa、bFGF均阳性表达组的MVD值高于其他组的MVD值。提示Hpa在卵巢癌中的表达增高能够促进卵巢癌的血管生成能力;Hpa有可能通过释放和激活bFGF来促进卵巢癌的血管生成,且二者对肿瘤的血管生成起着协同的作用。3.Kaplan-Meier法计算平均生存时间,Hpa表达阳性组的平均生存时间为583.97±77.19天,Hpa表达阴性组为682.33±100.97天,二者比较无显著性差异。提示Hpa不能作为卵巢癌的独立预后因素。