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戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)是戊型肝炎(Hepatitis E,HE)的病原体。HEV分为4个基因型,其中4型是我国流行的主要基因型。我国为HEV的流行区,HE占我国急性病毒性肝炎20%左右,病死率为1.4%-5.3%,而孕妇中的病死率可达25%,这使得HE成为一个重要的公共卫生问题。目前限制我国HEV研究的主要原因为缺乏一个高效稳定的HEV体外培养系统,虽然国外Tanaka和Shukla等分别于2007年和2011年建立了HEV的体外培养系统,但我们无法获得其毒种。本研究中,我们利用感染HEV 4型的恒河猴的粪便制备毒种,在PLC/PRF/5细胞中建立了HEV 4型的体外培养系统。通过积累经验和条件优化,提高细胞培养的效率和稳定性,并在此基础上,对HEV在细胞培养中的部分特性进行研究。取HEV 4型感染恒河猴4周后的粪便制备毒种,接种15株候选细胞株,结果显示HEV 4型仅可在PLC/PRF/5细胞中复制并释放至培养上清中。对HEV的接种时间和接种温度进行优化,接种时间为2、4、6和24小时条件下,1.0x106拷贝/mlHEV接种PLC/PRF/5细胞的出毒率(相对标准差,RSD)分别为：35%(RSD=39%)、60%(RSD=23%)、95%(RSD=12%)和100%(RSD=0%),接种时间2、4、6小时阳性率间具有显著性差异(p<0.05)。接种温度分别为37℃和40℃时,1.0×106拷贝/ml HEV接种PLC/PRF/5细胞的出毒率(RSD)分别为：35%(RSD=39%)和55%(RSD=20%),结果间无显著性差异(p≥0.05),最终确定接种时间为6小时,接种温度为40℃或37℃。使用DMEM/M199等比混合培养基替代MEM培养基做为PLC/PRF/5细胞生长培养基和维持培养基后,培养上清中HEV RNA的检出时间由接种后2周提前至接种后1周,pORF2检出时间由接种后4周提前至2—3周。分析DEMM/M199培养基同MEM培养基成份差异,确定12种物质可能影响HEV的出毒时间。分别测试这12种物质对于HEV出毒时间的影响,最终确定胆固醇的影响最大。以添加2μg/ml胆固醇的MEM培养基作为生长培养基和维持培养基,培养上清中HEV pORF2和RNA的变化趋势与以DMEM/M199为生长培养基和维持培养基时的变化趋势相同,说明培养基中添加胆固醇可显著提高HEV在PLC/PRF/5细胞中的感染和复制能力,该能力具有代次限制,PLC/PRF/5细胞需在含胆固醇培养基中培养至少3代,且该能力不能通过细胞冻存保留。攻毒细胞中未观察到明显的细胞病变。免疫荧光染色出毒后细胞,细胞内存在阳性荧光,激光共聚焦显微镜检测和比较接种细胞与对照细胞的圆度、面积,两者间无显著性差异(p≥0.05),接种细胞感染率约为10.1%。透射电镜观察培养上清和出毒后细胞,可见有包膜的病毒颗粒,通过交叉ELISA试验确定培养上清中的HEV病毒颗粒存在包膜结构,结果尚需免疫电镜确认。中和试验发现1株抗pORF2单抗(34#单抗)可中和培养上清中HEV病毒感染靶细胞,1份高滴度人血清样品(9EM)和两株单抗(15#和72#单抗)具有部分中和活性。使用分段表达的HEV 1型和4型pORF2片段定位3株单抗的识别表位,除72#单抗识别表位为构象型表位外,34#和15#单抗识别的表位均位于HEV 1型pORF2的390aa-607aa和HEV4型pORF2的404aa-621aa。HEV体外传代5个代次,各代次病毒接种后上清中HEVRNA浓度和pORF2 S/Co均值上升速度的差异不明显。基因芯片检测HEV感染引起的PLC/PRF/5细胞的基因表达谱的变化,4个IFN诱导基因表达水平发生变化,包括：IFI 27(7.07倍)、CMPK2(4.03倍)、IF16(3.82倍)和MX1(2.75倍)。继而又检测500IU/ml IFN-α2b处理对HEV复制的影响。与对照组比较,HEV的复制在IFN-α2b处理后1—7天被部分抑制,之后,处理组HEV的复制逐渐恢复,达到与对照组相当的水平。本研究中,我们建立并优化了HEV 4型的体外培养系统,并应用该系统对HEV的部分分子病毒学特性开展了初步研究,后继工作中,将利用该系统对HEV开展更加深入和细致的研究。