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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年人的慢性神经系统退行性疾病,随老龄化进程的加剧,逐渐影响着中老年人的身心健康,给患者乃至社会带来了沉重负担。帕金森病发病机制复杂,近年来,神经炎症机制引起普遍关注。原花青素生物学功能丰富,具有较强的抗炎抗氧化等功能。因而利用原花青素的抗炎和神经保护功能探索防治帕金森病成为研究热点。本研究首先建立体外帕金森病炎症损伤模型,以脂多糖(LPS)激活神经小胶质细胞(BV2细胞),原花青素进行干预,以BV2细胞上清刺激SH-SY5Y神经细胞,研究原花青素对BV2细胞激活介导的SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用,并重点研究了原花青素抑制小胶质细胞激活的作用机制,以期为探索防治帕金森病的新策略提供依据。本研究主要分为两部分:第一部分:原花青素对小胶质细胞介导的SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用研究目的:LPS诱导BV2细胞激活,建立帕金森病炎症损伤模型,观察原花青素对BV2细胞激活介导的SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用。研究方法:1、以不同浓度的LPS(0.01、0.1、1.0、10.0、20.0μg/mL)刺激BV2细胞,采用Griess法检测细胞上清中的一氧化氮(NO)浓度,确定适宜的染毒浓度,构建体外炎症损伤模型。2、采用MTT法检测实验剂量范围内LPS及原花青素本身浓度对BV2细胞活力的影响。设立调零组、对照组、LPS(1.0μg/mL)刺激组、不同浓度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)干预组以及LPS(1.0μg/mL)+原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)共同处理组,各组作用24 h后检测细胞存活率。3、采用MTT法检测BV2细胞上清刺激SH-SY5Y神经细胞对细胞活力的影响同时检测实验剂量范围内LPS及原花青素本身对SH-SY5Y细胞活力的影响。LPS(1.0μg/mL)激活BV2细胞的上清液作为炎症条件培养液(conditioned medium,CM),原花青素进行干预。设立对照组、LPS组、不同浓度原花青素处理组,正常培养条件下的BV2上清(C-CM)组、LPS诱导BV2细胞激活的炎症条件培养液(LPS-CM)组及LPS-CM+不同浓度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)共同处理组,各组作用24 h后检测细胞存活率。4、采用ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6水平。LPS激活BV2细胞,原花青素进行干预,设置对照组、LPS(1.0μg/mL)刺激组以及LPS(1.0μg/mL)+不同浓度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)处理组。各组作用24 h后检测细胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平。5、采用Annexin V-FITC/PI双染法检测BV2细胞条件培养液诱导SH-SY5Y神经细胞凋亡情况。设置对照组,BV2细胞炎症条件培养液(LPS-CM)干预组和不同浓度(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)原花青素条件培养液(PC-CM)处理组,作用于SH-SY5Y神经细胞,24 h后检测细胞凋亡水平。研究结果:1、不同浓度LPS刺激BV2细胞,与对照组相比,0.1、1.0、10.0、20.0μg/mL LPS均可增加BV2释放NO水平(P<0.05)。为确保炎症损伤细胞模型的建立并减少LPS对细胞不良影响,以1.0μg/mL LPS染毒BV2细胞进行后续实验。2、MTT结果显示,与对照组相比,0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL原花青素单独作用或与1.0μg/mL的LPS共同作用以及1.0μg/mL LPS单独作用,对BV2细胞存活率均无影响,差异无统计学意义(P>0.05)。在实验所用剂量范围内,LPS及原花青素对BV2细胞未产生毒性作用。3、MTT结果显示,与对照组相比,LPS(1.0μg/mL)或不同浓度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)单独作用SH-SY5Y细胞,对细胞存活率影响无统计学意义(P>0.05)。在本实验所用剂量范围内,LPS及原花青素对SH-SY5Y细胞未产生毒性作用。静息BV2细胞组培养液上清(C-CM)对细胞存活率的影响无统计学差异(P>0.05),而LPS激活的BV2细胞炎症条件培养液(LPS-CM)使SH-SY5Y细胞活力下降明显(P<0.05)。与C-CM组相比,炎症条件培养液处理使SH-SY5Y细胞存活率下降(P<0.05),与LPS-CM组比较,不同浓度原花青素+LPS-CM处理组可提高SH-SY5Y细胞活力(P<0.05)。4、ELISA检测结果显示,与对照组相比,LPS(1.0μg/mL)处理BV2细胞可提高TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平(P<0.05)。与LPS组相比,不同浓度(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)原花青素预处理可抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的释放且呈剂量-效应关系(P<0.05)。5、细胞凋亡检测结果显示,与对照组相比,炎症介质条件培养液处理SH-SY5Y细胞,明显促进SH-SY5Y细胞凋亡。不同浓度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)处理的条件培养液作用SH-SY5Y细胞可抑制LPS-CM诱导的细胞凋亡,且随原花青素浓度增大保护作用明显增强(P<0.05)。研究结论:LPS激活BV2神经小胶质细胞,释放TNF-α、IL-1β、IL-6炎症介质,介导SH-SY5Y细胞损伤,促进细胞凋亡。原花青素能有效抑制BV2细胞活化,降低炎症介质表达,保护SH-SY5Y细胞,抑制小胶质细胞介导的神经细胞凋亡。第二部分原花青素抑制小胶质细胞激活的信号通路研究研究目的:LPS诱导BV2细胞激活,建立帕金森病炎症损伤模型,观察TLR4-MyD88-ERK/p38/JNK MAPK信号通路在原花青素抑制脂多糖激活神经小胶质中的作用。研究方法:1、采用Western Blot法检测原花青素对LPS诱导BV2细胞TLR4、MyD88蛋白表达以及ERK、p38、JNK蛋白磷酸化的影响。设置对照组、LPS(1.0μg/mL)染毒组以及LPS(1.0μg/mL)+不同浓度原花青素(0.1、0.5、2.5、10μg/mL)共同处理组,PC比LPS提前1 h加入,检测TLR4、MyD88、p-ERK、p-p38以及p-JNK表达水平。2、应用TLR4、ERK、p38、JNK信号通路阻断剂,设立对照组、阻断剂组、LPS(1.0μg/mL)染毒组、LPS+阻断剂组以及LPS+PC(10.0μg/mL)处理组,采用Western Blot法检测TLR4、MyD88、p-ERK、p-p38以及p-JNK表达水平。研究结果:1、Western Blot法检测原花青素对TLR4受体、MyD88蛋白以及p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白表达水平的影响。结果显示,与对照组相比,LPS刺激BV2细胞后蛋白表达均显著升高(P<0.05)。与1.0μg/mL LPS染毒组相比,不同浓度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)预处理BV2细胞,可下调蛋白表达水平且呈剂量-效应关系(P<0.05)。2、应用信号通路阻断剂,Western Blot法检测原花青素对TLR4受体、MyD88蛋白以及p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白表达水平的影响。结果显示,与对照组相比,阻断剂单独作用于BV2细胞,对蛋白表达水平影响无统计学意义(P>0.05)。而1.0μg/mL LPS染毒组均可诱导蛋白水平显著升高(P<0.05)。与脂多糖组相比,LPS+阻断剂组均可下调蛋白表达水平(P<0.05)。原花青素进行干预,蛋白表达水平也显著下降(P<0.05)。证实原花青素可通过TLR4-MyD88-ERK/p38/JNK MAPK信号通路抑制脂多糖激活神经小胶质细胞。研究结论:LPS诱导BV2细胞TLR4-MyD88-ERK/p38/JNK MAPK信号通路的激活,TLR4、MyD88、p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白表达水平均明显增加。原花青素显著抑制蛋白表达,通过TLR4-MyD88-ERK/p38/JNK MAPK信号通路抑制脂多糖激活神经小胶质细胞。