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需氧菌性阴道炎(Aerobic Vaginitis,AV)是2002年新提出的以乳酸杆菌减少,需氧菌增多为特征的一种阴道感染类型。AV的常见致病菌包括大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等革兰阴性或革兰阳性菌。Toll样受体(Toll Like Receptors,TLR)2和TLR4可分别识别革兰阳性菌细菌胞壁主要成分肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)和革兰阴性菌细菌胞壁主要成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),调控下游细胞因子合成及分泌。本团队前期研究显示,AV患者阴道中促炎性细胞因子,如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等水平升高,但具体分子机制尚不十分清楚。因此,本研究分三部分:用AV常见致病菌(大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌)、LPS及PGN刺激永生化人阴道上皮VK2/E6E7细胞,用AV常见致病菌构建SD大鼠AV模型,通过体外、体内试验探讨AV致病机制中TLR2/4/NF-κB信号通路及下游细胞因子的作用。目的第一部分:观察AV常见致病菌刺激对VK2/E6E7细胞TLR2/4/NF-κB信号通路的活化及下游细胞因子释放的影响。第二部分:观察LPS及PGN刺激及TLR2、TLR4中和抗体的应用对VK2/E6E7细胞TLR2/4/NF-κB信号通路的活化及下游细胞因子释放的影响。第三部分:建立SD大鼠AV模型,通过体内实验观察TLR2/4/NF-κB信号通路在AV常见致病菌感染中的作用。方法第一部分:应用革兰阴性大肠埃希菌标准菌株(ATCC 25922)和革兰阳性金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC 29213)分别刺激VK2/E6E7细胞,通过Real Time RT-PCR、Western Blot、免疫荧光及Luminex液相芯片及ELISA方法,观察TLR2/4信号传导通路关键蛋白活化及下游细胞因子水平变化。第二部分:应用LPS及PGN分别刺激VK2/E6E7细胞,通过Real Time RT-PCR、Western Blot、免疫荧光及Luminex液相芯片及ELISA方法,观察TLR2/4信号传导通路关键蛋白活化及下游细胞因子水平变化;应用TLR2、TLR4中和抗体,探究TLR2、TLR4在TLR2/4信号传导通路活化的作用。第三部分:应用25922菌株、29213菌株及混合菌株构建SD大鼠AV模型,通过pH值测定、HE染色、石蜡切片、冰冻切片免疫组织化学法,观察TLR2/4信号传导通路的作用。结果第一部分:(1)25922菌株及29213菌株刺激可上调VK2/E6E7细胞TLR2、TLR4、NF-κB的表达。(2)25922菌株与VK2/E6E7细胞共培养2小时,促炎性细胞因子IL-6及IFN-γ水平明显升高,共培养4小时后,IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ及TNF-α水平也明显升高。(3)29213菌株与VK2/E6E7共培养2小时,促炎性细胞因子IL-32及IFN-γ水平明显升高;共培养4小时,IL-2、IL-8、IL-17A、IL-18、IL-32及IFN-γ水平明显升高。第二部分:(1)LPS及PGN刺激可上调VK2/E6E7细胞TLR2、TLR4、NF-κB的表达;应用TLR2、TLR4中和抗体后,LPS及PGN对NF-κB p65的活化作用明显减弱。(2)LPS处理VK2/E6E7细胞后,促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23水平明显升高,且具有时间依赖性。(3)PGN处理VK2/E6E7细胞后,促炎性细胞因子IL-8水平明显升高。第三部分:(1)造模后,各实验组大鼠阴道pH值明显升高。(2)细菌接种完成后第3天及第7天,与对照组大鼠相比,各实验组大鼠阴道黏膜呈不同程度的炎症改变(3)细菌接种完成后第3天及第7天,与对照组大鼠相比,实验组大鼠阴道组织内NF-κB p65的表达水平明显升高。结论第一部分:AV常见致病菌可刺激VK2/E6E7细胞内TLR2/4/NF-κB信号通路活化,促进下游细胞因子释放。第二部分:LPS和PGN可通过TLR2、TLR4刺激VK2/E6E7细胞内TLR2/4/NF-κB信号通路活化,促进下游细胞因子释放。第三部分:TLR2、TLR4表达均为阳性的SD大鼠阴道内感染25922菌株和或29213菌株时,TLR2/4/NF-κB信号通路活化,导致阴道黏膜炎症细胞浸润。