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研究背景：
结直肠癌是世界第三常见的恶性肿瘤，我国结直肠癌以每年约3-4%的速度递增(37.63万例新发/每年)。寻找结肠癌发生发展中的关键分子，对于进一步阐明其可能的发病机制，提供更加精准的预测指标和临床诊疗方案具有重要的意义。
实体肿瘤增殖转移是一个多步骤多阶段的过程，通常伴随着正常组织稳态环境的破坏以及肿瘤相关环境的重塑等过程。低氧是肿瘤发生发展中代偿性代谢变化的重要特点。近年来，细胞间通讯的重要媒介外泌体，作为肿瘤恶性进展及转移相关的“孵化器”，介导参与了肿瘤细胞以及各种细胞之间的信号传导。研究表明，低氧环境能调节肿瘤细胞外泌体中搭载的物质从而促进肿瘤的增殖转移。然而，低氧条件能否影响结肠癌细胞释放外泌体及其搭载的分子物质，进一步影响结肠癌细胞的恶性生物学行为尚缺乏深入的研究和报道。
本项研究主要旨在探讨低氧环境下，结肠癌细胞产生的外泌体对细胞恶性生物学行为的作用，并进一步通过miRNA表达谱分析筛选低氧外泌体中差异表达的miRNA，探索其对结肠癌细胞的作用及潜在分子机制。
研究方法：
1.结肠癌细胞外泌体的提取鉴定
通过差速离心法或外泌体提取试剂盒提取细胞培养上清中的外泌体。通过透射电镜观察外泌体形态大小；Westernblot验证外泌体表面的标记蛋白来鉴定外泌体。
2.低氧结肠癌细胞外泌体对肿瘤细胞生物学行为的影响
通过外泌体标记示踪法研究低氧外泌体和常氧细胞之间的相互作用；通过体外细胞增殖实验(CCK-8和细胞克隆形成实验)和细胞迁移实验(细胞划痕和Transwell实验)研究低氧外泌体对结肠癌细胞生物学行为的影响。
3.低氧结肠癌细胞外泌体miRNA表达谱筛选验证及HIF-1α对miRNA的调控
通过分析细胞和外泌体miRNA表达谱，筛选出低氧相关差异表达的miRNA(miR-4299)，在低氧细胞及其外泌体中qPCR验证表达；通过双荧光素酶报告基因实验验证低氧诱导因子HIF-1α对miR-4299的转录调控作用。
4.miR-4299调控结肠癌细胞生物学行为
通过miRNAmimics及inhibitors分别过表达和下调结肠癌细胞中miR-4299的表达，采用体外增殖迁移实验(CCK-8和细胞克隆形成实验，细胞划痕和Transwell实验)以及体内裸鼠皮下成瘤和尾静脉肺转移的动物实验，研究miR-4299对结肠癌细胞生物学行为的影响。
5.miR-4299通过下游转录抑制因子ZBTB4调控结肠癌细胞的生物学行为
利用miRNA在线数据库(miRDB、DIANA以及TargetScan)预测miR-4299可能调控的下游靶基因，验证挑选ZBTB4作为潜在候选靶基因。通过双荧光素酶报告基因检测明确miR-4299对ZBTB4的转录调控机制。siRNA靶向干扰下游靶基因ZBTB4后，通过CCK-8和细胞克隆形成的增殖实验，细胞划痕和Transwell的迁移实验检测ZBTB4对结肠癌细胞生物学行为的影响。
结果：
1.低氧和常氧下结肠癌细胞外泌体的鉴定
通过透射电镜鉴定提取的细胞外泌体为大小30至150nm的圆形颗粒。通过Westernblot验证表面标记蛋白CD63和CD81，证实发现在低氧和常氧状态下结肠癌细胞可以分泌外泌体。
2.低氧结肠癌细胞来源外泌体可促进常氧细胞的增殖和迁移能力
通过外泌体示踪实验发现Dio标记后低氧结肠癌细胞外泌体能够进入受体常氧结肠癌细胞，并且随着时间延长而逐渐增多。CCK-8增殖和Transwell迁移实验发现，低氧外泌体处理后，常氧结肠癌细胞增殖活性明显增加，迁移到小室下层的细胞数量明显增加。
3.低氧结肠癌细胞外泌体miRNA表达谱差异的筛选和验证
分析比对低氧/常氧下结肠癌细胞及其所分泌的外泌体中miRNA表达谱的差异，发现共有281个miRNAs在低氧外泌体中发生显著改变(121差异miRNAs上调，160差异miRNAs下调)；其中miR-4299，miR-4257，miR-5787，miR-1246等在低氧细胞以及其外泌体中同时上调较明显。通过qPCR验证发现miR-4299和miR-4257在低氧细胞及其相应外泌体中均显著升高。
4.低氧下Hif-1α相关途径调控结肠癌细胞miR-4299的表达
通过JASPAR在线预测发现miR-4299基因启动子区存在潜在的低氧反应元件(HRE)区(“ACGTG”)；低氧培养下，miRNA启动子区的报告基因荧光素酶活性增加，当靶向干扰HIF-1α后，发现低氧下miR-4299的启动子区荧光素酶活性明显降低，证实了HIF-1α对miR-4299的转录调控，表明低氧诱导的miR-4299高表达可能依赖于HIF-1α途径。
5.miR-4299促进结肠癌肿瘤的增殖和转移
miR-4299mimics能够显著增加结肠癌细胞增殖活力和集落数，并增强细胞的迁移和划痕愈合能力；而miR-4299inhibitors可以抑制上述细胞的生物学行为。体内裸鼠皮下成瘤和尾静脉肺转移动物模型，发现结肠癌细胞过表达miR-4299可以促进皮下移植瘤生长以及肿瘤肺转移，降低裸鼠存活时间。表明miR-4299能促进结肠癌细胞的增殖和转移。
6.miR-4299通过ZBTB4促进结肠癌细胞增殖迁移
利用在线数据库预测ZBTB4是miR-4299可能的下游靶基因。当转染miR-4299mimics后，ZBTB43-UTR报告基因的荧光素酶活性明显降低，ZBTB4的3-UTR突变后荧光素酶活性相对无明显变化。证实了miR-4299能够通过结合ZBTB4的3-UTR位点，负向调控ZBTB4的表达。体外试验发现miR-4299inhibitors抑制结肠癌细胞增殖和迁移，而当与ZBTB4siRNA共转染后，可部分恢复结肠癌细胞的增殖和迁移能力。进一步体内裸鼠尾静脉肺转移动物模型，发现结肠癌细胞敲低ZBTB4可以促进小鼠肿瘤肺转移。
结论：
1.低氧结肠癌细胞释放的外泌体能被常氧细胞内化，增强常氧细胞的增殖和迁移能力。
2.低氧条件下，结肠癌细胞外泌体的miRNAs表达谱发生显著变化；其中miR-4299受HIF-1α的转录调控，在低氧细胞及外泌体中表达明显增加。
3.miR-4299可以通过下游靶基因ZBTB4，促进结肠癌细胞增殖和转移。
结直肠癌是世界第三常见的恶性肿瘤，我国结直肠癌以每年约3-4%的速度递增(37.63万例新发/每年)。寻找结肠癌发生发展中的关键分子，对于进一步阐明其可能的发病机制，提供更加精准的预测指标和临床诊疗方案具有重要的意义。
实体肿瘤增殖转移是一个多步骤多阶段的过程，通常伴随着正常组织稳态环境的破坏以及肿瘤相关环境的重塑等过程。低氧是肿瘤发生发展中代偿性代谢变化的重要特点。近年来，细胞间通讯的重要媒介外泌体，作为肿瘤恶性进展及转移相关的“孵化器”，介导参与了肿瘤细胞以及各种细胞之间的信号传导。研究表明，低氧环境能调节肿瘤细胞外泌体中搭载的物质从而促进肿瘤的增殖转移。然而，低氧条件能否影响结肠癌细胞释放外泌体及其搭载的分子物质，进一步影响结肠癌细胞的恶性生物学行为尚缺乏深入的研究和报道。
本项研究主要旨在探讨低氧环境下，结肠癌细胞产生的外泌体对细胞恶性生物学行为的作用，并进一步通过miRNA表达谱分析筛选低氧外泌体中差异表达的miRNA，探索其对结肠癌细胞的作用及潜在分子机制。
研究方法：
1.结肠癌细胞外泌体的提取鉴定
通过差速离心法或外泌体提取试剂盒提取细胞培养上清中的外泌体。通过透射电镜观察外泌体形态大小；Westernblot验证外泌体表面的标记蛋白来鉴定外泌体。
2.低氧结肠癌细胞外泌体对肿瘤细胞生物学行为的影响
通过外泌体标记示踪法研究低氧外泌体和常氧细胞之间的相互作用；通过体外细胞增殖实验(CCK-8和细胞克隆形成实验)和细胞迁移实验(细胞划痕和Transwell实验)研究低氧外泌体对结肠癌细胞生物学行为的影响。
3.低氧结肠癌细胞外泌体miRNA表达谱筛选验证及HIF-1α对miRNA的调控
通过分析细胞和外泌体miRNA表达谱，筛选出低氧相关差异表达的miRNA(miR-4299)，在低氧细胞及其外泌体中qPCR验证表达；通过双荧光素酶报告基因实验验证低氧诱导因子HIF-1α对miR-4299的转录调控作用。
4.miR-4299调控结肠癌细胞生物学行为
通过miRNAmimics及inhibitors分别过表达和下调结肠癌细胞中miR-4299的表达，采用体外增殖迁移实验(CCK-8和细胞克隆形成实验，细胞划痕和Transwell实验)以及体内裸鼠皮下成瘤和尾静脉肺转移的动物实验，研究miR-4299对结肠癌细胞生物学行为的影响。
5.miR-4299通过下游转录抑制因子ZBTB4调控结肠癌细胞的生物学行为
利用miRNA在线数据库(miRDB、DIANA以及TargetScan)预测miR-4299可能调控的下游靶基因，验证挑选ZBTB4作为潜在候选靶基因。通过双荧光素酶报告基因检测明确miR-4299对ZBTB4的转录调控机制。siRNA靶向干扰下游靶基因ZBTB4后，通过CCK-8和细胞克隆形成的增殖实验，细胞划痕和Transwell的迁移实验检测ZBTB4对结肠癌细胞生物学行为的影响。
结果：
1.低氧和常氧下结肠癌细胞外泌体的鉴定
通过透射电镜鉴定提取的细胞外泌体为大小30至150nm的圆形颗粒。通过Westernblot验证表面标记蛋白CD63和CD81，证实发现在低氧和常氧状态下结肠癌细胞可以分泌外泌体。
2.低氧结肠癌细胞来源外泌体可促进常氧细胞的增殖和迁移能力
通过外泌体示踪实验发现Dio标记后低氧结肠癌细胞外泌体能够进入受体常氧结肠癌细胞，并且随着时间延长而逐渐增多。CCK-8增殖和Transwell迁移实验发现，低氧外泌体处理后，常氧结肠癌细胞增殖活性明显增加，迁移到小室下层的细胞数量明显增加。
3.低氧结肠癌细胞外泌体miRNA表达谱差异的筛选和验证
分析比对低氧/常氧下结肠癌细胞及其所分泌的外泌体中miRNA表达谱的差异，发现共有281个miRNAs在低氧外泌体中发生显著改变(121差异miRNAs上调，160差异miRNAs下调)；其中miR-4299，miR-4257，miR-5787，miR-1246等在低氧细胞以及其外泌体中同时上调较明显。通过qPCR验证发现miR-4299和miR-4257在低氧细胞及其相应外泌体中均显著升高。
4.低氧下Hif-1α相关途径调控结肠癌细胞miR-4299的表达
通过JASPAR在线预测发现miR-4299基因启动子区存在潜在的低氧反应元件(HRE)区(“ACGTG”)；低氧培养下，miRNA启动子区的报告基因荧光素酶活性增加，当靶向干扰HIF-1α后，发现低氧下miR-4299的启动子区荧光素酶活性明显降低，证实了HIF-1α对miR-4299的转录调控，表明低氧诱导的miR-4299高表达可能依赖于HIF-1α途径。
5.miR-4299促进结肠癌肿瘤的增殖和转移
miR-4299mimics能够显著增加结肠癌细胞增殖活力和集落数，并增强细胞的迁移和划痕愈合能力；而miR-4299inhibitors可以抑制上述细胞的生物学行为。体内裸鼠皮下成瘤和尾静脉肺转移动物模型，发现结肠癌细胞过表达miR-4299可以促进皮下移植瘤生长以及肿瘤肺转移，降低裸鼠存活时间。表明miR-4299能促进结肠癌细胞的增殖和转移。
6.miR-4299通过ZBTB4促进结肠癌细胞增殖迁移
利用在线数据库预测ZBTB4是miR-4299可能的下游靶基因。当转染miR-4299mimics后，ZBTB43-UTR报告基因的荧光素酶活性明显降低，ZBTB4的3-UTR突变后荧光素酶活性相对无明显变化。证实了miR-4299能够通过结合ZBTB4的3-UTR位点，负向调控ZBTB4的表达。体外试验发现miR-4299inhibitors抑制结肠癌细胞增殖和迁移，而当与ZBTB4siRNA共转染后，可部分恢复结肠癌细胞的增殖和迁移能力。进一步体内裸鼠尾静脉肺转移动物模型，发现结肠癌细胞敲低ZBTB4可以促进小鼠肿瘤肺转移。
结论：
1.低氧结肠癌细胞释放的外泌体能被常氧细胞内化，增强常氧细胞的增殖和迁移能力。
2.低氧条件下，结肠癌细胞外泌体的miRNAs表达谱发生显著变化；其中miR-4299受HIF-1α的转录调控，在低氧细胞及外泌体中表达明显增加。
3.miR-4299可以通过下游靶基因ZBTB4，促进结肠癌细胞增殖和转移。