基于乙二醛酶的耐盐萱草育种研究

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植物在逆境条件下会积累过量有毒醛类化合物(如甲基乙二醛),乙二醛酶可有效的清除此类化合物以维持体内平衡。研究表明过量表达乙二醛酶基因可明显增加植物的抗盐能力,而提高植物抗逆能力一直是植物育种的重要方向之一。为了研究乙二醛酶的耐盐筛选体系,通过测定多品种萱草的乙二醛酶活力,筛选出酶活力较高和较低的品种。采用不同含有盐浓度的基质对酶活力不同的萱草进行处理,并测定不同处理时间萱草样品的乙二醛酶活力、甲基乙二醛和丙二醛含量,进行耐盐性验证。此外,本实验还研究萱草乙二醛酶基因的功能及其与耐盐能力的关系,主要分为以下四个部分。(1)通过分析萱草二、三代转录组数据,以及荧光定量PCR筛选萱草6个器官和盐胁迫下的内参基因。(2)通过以随机筛选的30个萱草品种为材料测定乙二醛酶,选择酶活力最高及最低的萱草品种进行耐盐性测定,并对萱草品种的乙二醛酶活力、耐盐性和乙二醛酶相关转录本表达水平进行相关性分析。(3)把不同耐盐能力的萱草在含有不同浓度氯化钠的基质上培养,通过实时荧光定量PCR检测各种萱草乙二醛酶转录本的表达量。(4)克隆乙二醛酶最相关的转录本(命名为Hf Gl XI-1),构建过量表达载体,并利用花粉管通道法转化法进行遗传转化,并对转基因植物进行鉴定。内参基因选择是第一次评价萱草参考基因稳定性的报告,将为该物种基因表达分析提供参考。在转录组测序的基础上克隆了Hf Gl XI-1全长c DNA,采用花粉管通道方法获得了过量表达的转基因萱草,以期阐明乙二醛酶基因在萱草中的功能,同时为萱草抗盐新品种繁育提供参考。了解盐胁迫和各种萱草乙二醛酶I活力的相关性可为快速、准确选择耐盐性园林植物提供理论依据。实验的主要结论如下:1.萱草三代转录组unigene的分析显示6个基因[肌动蛋白丝解聚蛋白(Hf ADF)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Hf GAPDH)、Hf TIP41类似蛋白(TIP41)、微管蛋白基因(Hf TUB)、延伸因子基因(Hf EF1a)和泛素蛋白基因(Hf UBQ)]在萱草内存在较多的转录本,转录本数量最多的是Hf UBQ(40个),其次是Hf EF-1-α(19个);最少的是Hf TIP41(3个),其次是Hf TUB(5个);注释为Hf ADF的转录本为13个,Hf GAPDH有15个。萱草6个不同器官研究的最优内参基因为Hf TIP41和Hf GAPDH。高盐胁迫的萱草选取六个候选内参基因:Hf ADF、Hf TUB、Hf GAPDH、Hf TIP41、F-box蛋白(Hf F-box)和Hf UBQ进行q RT-PCR。结果显示盐胁迫下的萱草最优内参基因为Hf F-box和Hf UBQ,不宜选择的基因是Hf TUB。2.通过测定多种萱草的乙二醛酶I的活力,筛选出两个酶活力比较高的植株:‘金娃娃’、‘宁静摩根’;两个酶活力比较低的植株:‘双重奏’、‘大眼睛’。采用0、1.0%的Na Cl的基质对筛选到的4个萱草品种进行处理,发现‘大眼睛’、‘双重奏’的叶片在第1天开始变黄,而‘金娃娃’和‘宁静摩根’的叶片在第2天才开始有明显的发黄。说明‘金娃娃’和‘宁静摩根’比较耐盐,而‘金娃娃’和‘宁静摩根’对盐处理敏感。3.甲基乙二醛(MG)、乙二醛酶活性与耐盐性相关性分析显示萱草的耐盐性和乙二醛酶活性存在显著正相关。乙二醛酶活性较高时,萱草的耐盐性越强。4.对盐胁迫下的萱草进行荧光定量PCR,萱草乙二醛酶转录本的表达量在不同的萱草中表现出差异。选择高盐胁迫1天时的酶活力和4个专录本的表达量进行相关性分析,结果显示:乙二醛酶酶活力与转录本24211(命名为Hf Gl XI-1)存在显著正相关,与25335和20549存在弱的正相关。所以推测转录本24211在乙二醛酶酶活力中起主要作用,为后续的基因克隆和转基因提供参考。5.根据萱草三代转录组测序结果,并通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法首次从萱草中克隆了乙二醛酶(Hf Gl XI-1)的编码序列(coding sequence,CDS)的全长。6.克隆的乙二醛酶基因的CDS全长885 bp,编码295个氨基酸,分子进化树分析显示该基因编码的蛋白质属于乙二醛酶进化枝I(Clade I),即具有乙二醛酶活性。蛋白质高级结构预测显示Hf GLXI-1主要由无规则卷曲、α螺旋和延伸链组成,其配体为二价钴离子和谷胱甘肽,与乙二醛酶的性质相符。通过PCR扩增结果显示扩增得到的基因组DNA条带大小与该基因CDS的分子量相近,测序结果表明上述两者序列完全一致,推测Hf GLXI-1基因不存在内含子。7.构建了35S::Hf GLXI1融合基因,并通过花粉管通道转化获得5株阳性转基因萱草植株,并通过基因组DNA扩增验证。
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