植物的耐盐性是多基因控制的复杂性状。在植物响应盐胁迫的信号通路中,参与盐胁迫响应的关键转录因子,接受上游的信号后,通过调控下游众多基因的表达,协调多个生理反应响应盐胁迫。因此,在分子网络中起承上启下的核心作用。WRKY是一个超级转录因子家族,大量的研究证明WRKY参与植物响应生物胁迫,近几年的研究发现WRKY也参与植物响应非生物胁迫。本实验室的前期研究表明WRKY可能在苹果的盐响应过程中起关键作用,但机制仍有待探索。本研究分离和克隆参与苹果盐胁迫应答的MdWRKY9基因,并进行深入的功能研究,为揭示苹果属植物盐胁迫应答机理打下基础。结果如下:1.本试验克隆了盐应答基因MdWRKY9。qPCR结果显示MdWRKY9在根和叶中都受到盐胁迫的诱导,并且响应盐胁迫时间较早。生物信息学分析发现该基因具有WRKYGQK的保守结构域,属于第Ⅱ家族d亚组的WRKY蛋白。亚细胞定位的结果显示MdWRKY9定位于细胞核中。酵母自激活试验和原生质体转录抑制试验证明MdWRKY9可能是一个转录抑制子。2.通过根癌农杆菌介导的转化,获得了超表达MdWRKY9的转基因M26植株和愈伤。盐胁迫处理下,超表达MdWRKY9的转基因植株和愈伤的耐盐性显著强于对照M26植株和愈伤。通过ChIP-qPCR、EMSA、qPCR等试验发现MdWRKY9可以在体内和体外直接结合MdNHX4的启动子,抑制MdNHX4的表达,从而降低液泡对K离子的区隔化,因此提高转基因植株和愈伤的耐盐性。3.通过免疫共沉淀苹果叶片总蛋白,进一步的磷酸酶处理证明MdWRKY9在体内存在磷酸化。体内BiFC,Co-IP和体外pull-down试验证明MdWRKY9可以和MdMAPK6互作,MdMAPK6可以和MdMAPKK9互作。体外磷酸化试验证明MdWRKY9可以被MdMAPKK9/MdMAPK6级联磷酸化。瞬时转化愈伤进行ChIP-qPCR和GUS染色试验证明,MAPK对于MdWRKY9的磷酸化可以进一步增强MdWRKY9结合MdNHX4启动子的能力,抑制MdNHX4的表达。4.正常生长状态下,超表达MdWRKY9的转基因M26植株具有节间距变短,进一步矮化等表型。超表达MdWRKY9的转基因M26植株其生根率降低,根长变长,不定根的数量显著低于对照M26植株。超表达MdWRKY9的转基因M26植株中油菜素内脂（BR）和油菜素甾酮（CS）含量显著下降,外源喷施BL可以部分逆转超表达MdWRKY9的转基因植株的矮化表型。5.通过ChIP-qPCR、EMSA、GUS染色等试验发现MdWRKY9可以通过直接结合BR合成限速基因MdDWF4的启动子,抑制MdDWF4的表达,降低BR含量。通过RNAi MdWRKY9并瞬时转化愈伤的方法证明MdWRKY9在调控MdD WF4的表达中起非常关键的作用。综上所述,MdWRKY9通过调控“离子平衡”,以及主动抑制生长,使植株进入“防御状态”,调控了苹果的盐胁迫响应。