【摘 要】
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目的近年来,临床迫切需要寻求安全有效治疗心肌缺血再灌注损伤的药物。八味沉香散是中国传统藏成药,藏医临床主要用于治疗冠心病,动物实验研究发现其有抗心肌缺血损伤作用,但缺乏从细胞分子机制方面的探究和分析。因此本实验采用血清药理学方法研究八味沉香散在细胞水平抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用及分子机制。方法1.以细胞存活率和细胞上清液中LDH含量为指标,采用正交试验,优化2%氧浓度下H9C2细胞缺氧/复氧模
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目的近年来,临床迫切需要寻求安全有效治疗心肌缺血再灌注损伤的药物。八味沉香散是中国传统藏成药,藏医临床主要用于治疗冠心病,动物实验研究发现其有抗心肌缺血损伤作用,但缺乏从细胞分子机制方面的探究和分析。因此本实验采用血清药理学方法研究八味沉香散在细胞水平抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用及分子机制。方法1.以细胞存活率和细胞上清液中LDH含量为指标,采用正交试验,优化2%氧浓度下H9C2细胞缺氧/复氧模型。2.实验分为空白组、模型组和药物组,药物组分为低剂量组（八味沉香散以2.5 g/kg灌胃大鼠后的血清）、中剂量组（八味沉香散以8 g/kg灌胃大鼠后的血清）和高剂量组（八味沉香散以12 g/kg灌胃大鼠后的血清）。不同剂量的八味沉香散含药血清干预缺氧/复氧的H9C2细胞。3.CCK-8法测定细胞存活率;生化法测定细胞上清液中LDH含量（or活性）;ELISA法测定细胞上清液中CK,GSH-Px,SOD,CAT,ComplexⅠ和MDA含量;光镜和电镜观察细胞形态和细胞超微结构;流式细胞仪和荧光显微镜测定细胞中活性氧含量和细胞凋亡率;实时荧光定量PCR或蛋白免疫印迹实验测定氧化应激相关因子（Ndufa10、Nrf2、Keap1、HO-1和Trx）、凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cytc）和信号通路蛋白PI3K/AKT/GSK3β的基因或蛋白表达。结果1.通过正交试验确定2%氧浓度下,20%空白血清、无糖培养基、缺氧8h;21%氧浓度下,20%空白血清、高糖培养基、复氧4h作为心肌细胞缺氧/复氧的最优模型条件。2.与模型组相比,药物组细胞存活率显著上升,上清液中LDH、CK和MDA含量显著下降;GSH-Px、SOD、ComplexⅠ和CAT含量显著上升。3.与模型组相比,给药组光镜下死细胞数量减少,细胞壁破损程度降低;电镜下细胞形态结构较正常,仅少数线粒体发生轻度肿胀,胞浆内可见大量脂滴和少量自噬,部分细胞内有少量轻度扩张的粗面内质网;给药组荧光显微和流式细胞仪测定发现活性氧含量显著下降,细胞凋亡率显著下降。4.与模型组相比,药物组氧化应激相关因子Nrf2、Keap1、HO-1、Ndufa10和Trx的基因和蛋白表达显著降低;凋亡因子Bax、Caspase-3和Cytc的基因和蛋白表达显著降低,抗凋亡因子Bcl-2的基因和蛋白表达显著上升。5.PI3K/AKT/GSK3β信号通路中PI3K和AKT的蛋白和基因表达显著降低,GSK3β表达显著升高。结论1.优化了心肌细胞最佳缺氧/复氧模型,优化的缺氧/复氧模型为20%大鼠空白血清、无糖培养基、（2%氧浓度）缺氧8 h;正常培养基、常氧（21%氧浓度）复氧4 h。2.通过对细胞存活率、上清液中氧化应激相关指标、线粒体微观结构、活性氧含量、氧化应激相关基因和蛋白的检测结果显示,八味沉香散含药血清对心肌细胞缺氧/复氧后的氧化应激损伤有保护作用,其作用可能通过降低心肌细胞缺氧/复氧后产生的氧化应激损伤而发挥的。3.八味沉香散含药血清可促进抗凋亡因子Bcl-2的基因和蛋白表达,抑制凋亡因子Bax、Caspase-3和Cytc的基因和蛋白表达,进而抑制缺氧/复氧心肌细胞的凋亡,产生缺氧/复氧心肌细胞的保护作用。4.八味沉香散含药血清可上调PI3K和AKT基因和蛋白的表达,下调GSK3β的基因和蛋白表达,说明八味沉香散通过调控细胞的生存通路PI3K/AKT/GSK3β通路,进而抑制氧化应激、线粒体途径细胞凋亡,产生抗心肌缺氧复氧损伤作用。5.八味沉香散含药血清降低缺氧8小时的H9C2细胞培养液中LDH、CK和MDA含量,增加GSH-PX,SOD,CAT和ComplexⅠ含量,表明八味沉香散含药血清可抑制缺氧心肌细胞的过氧化反应,对心肌细胞缺氧造成的损伤有一定的保护作用。
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