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多种原因所致的骨缺损在医学临床较为常见,以种子细胞与生物材料结合的骨组织工程已成为修复骨缺损的理想方法。羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)是一种生物材料,在以往研究中发现其对骨细胞和骨组织有着非常好的生物相容性和成骨生物活性,因此其被广泛用作骨缺损移植物。丝素蛋白(Silk Fibroin,SF)取自蚕丝,有着良好的生物相容性、可降解性和优异的综合力学性能。将羟基磷灰石与丝素蛋白复合,可以克服HA材料脆性大和抗疲劳性能差的缺点,又可以解决SF机械性能差、易溶解的问题,逐渐成为骨组织工程支架材料研究的热点。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)因具有良好的体外扩增能力,且具有成骨分化潜能,已成为组织工程骨的重要种子细胞来源。然而困扰骨组织工程的一大难题是对植入体内的支架材料缺乏有效的识别和追踪监测手段,因而难以明确外源性支架在骨缺损修复中的作用、材料降解过程中的形态变化及分子生物学过程。因此迫切需要探索一种对植入体内的支架材料进行追踪和监测的安全无创的手段,以促进组织工程骨修复骨缺损研究的进一步深入。磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)是常用的影像诊断技术,能在不同时间无创、重复地评估同一活体的解剖及生理学变化。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide,USPIO)是一种新型T2磁共振纳米造影剂,被广泛用于临床前研究,其生物安全性与生物相容性良好。据此,本课题拟用USPIO标记SF/HA支架,并与BMSCs复合培养,在验证该复合材料的生物相容性和体外MRI成像稳定性的基础上,制作裸鼠皮下异位成骨模型,对该复合材料异位成骨的作用进行评估,利用3T MRI结合CT检查在体示踪USPIO标记的BMSCs-SF/HA支架复合物降解过程中的形态变化及成骨功能改变,为骨组织工程的活体监测提供一种安全无创、动态直观的新技术,并为骨组织工程临床应用的即时监测及疗效评定奠定基础。目的:1、制备不同浓度USPIO标记的SF/HA支架,对其理化性质进行评价,并通过MRI成像及细胞毒性实验确定USPIO标记支架的最佳浓度。2、将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合到SF/HA支架上,进行一系列体外实验,明确共同培养后BMSCs在材料上的生长状况、成骨分化能力及MRI成像特征。3、将BMSCs-SF/HA支架复合物成骨诱导后制作裸鼠皮下异位成骨模型,评估材料异位成骨的能力以及用MRI监测材料体内变化的效果,并结合CT及病理检查对结果进行验证。材料与方法:1、制备不同USPIO含量的SF/HA复合生物材料,进行物理表征后行体外MRI扫描,评价其MRI图像特征,测定材料的细胞毒性,结合MRI图像与细胞毒性实验,选出适合后续实验的最佳SPIO浓度。2、将BMSCs接种于未标记与USPIO标记的SF/HA支架材料上,成骨诱导培养后,在不同的时间点检测细胞形态及增殖情况、碱性憐酸酶活性、成骨特异性基因的表达情况;用3T MRI评价成骨诱导下支架复合物的形貌、信号改变情况。3、使用BMSCs-SF/HA支架复合物制作裸鼠皮下异位成骨模型。在2、6、8周行磁共振扫描,通过计算R2、R2*值来对材料内USPIO的含量变化及成骨情况进行判断;行CT检查证实材料的成骨过程;行H&E染色、马松三色染色观察成骨情况;行ICP-MS对材料内残余铁进行定量研究。结果:1、根据支架的表征结果,可以得知标记USPIO的HA/SF复合支架其形貌结构及化学性质未发生明显改变。磁共振扫描表明含铁量从低到高,T2WI信号逐渐降低,证明在支架里掺USPIO的负性造影效果。其中含铁量在0.75-1.5%(w/w%)时T2WI图像较均匀,细胞毒性实验证明USPIO含量较高(>1%)时细胞增值率稍降低,综上结果,选择了 USPIO含量为0.75%为最佳标记浓度,用以进行后续实验。2、体外实验证实标记USPIO与未标记的SF/HA材料都具备良好的细胞相容性,扫描电镜及Live/Dead染色证明了 BMSCs的形态及增殖未受到USPIO掺入的影响。ALP活性及成骨基因的表达证实了材料的体外成骨能力。3、异位成骨中,CT结果提示组织标本的骨密度逐渐升高,磁共振T2WI上可见未标记组信号随时间降低,R2值升高,标记组则信号逐渐升高,R2及R2*值则呈上升的趋势。组织学显示各组材料均呈现不同程度降解并伴随新生骨组织生长。结论:本实验制备了 SF/HA支架,并成功将USPIO复合入支架内,通过细胞毒性实验及磁共振成像,确认了用于支架造影的最佳USPIO浓度为0.75%。体外细胞实验证明了标记了 USPIO的SF/HA支架与未标记的支架皆具有良好的生物相容性,大鼠BMSCs在材料表面具有旺盛的增殖活力,并且有良好的成骨分化能力,且体外MRI成像较稳定。体内实验表明,负载BMSCs的USPIO-SF/HA支架能在裸鼠皮下异位成骨,且能通过USPIO减少引起的MRI信号变化无创监测材料的降解,材料的CT密度增加能证明其成骨变化过程。综上,磁共振能无创监测骨组织工程支架体外及体内影像特征变化及降解过程,能作为骨组织工程长期监测的一种有效手段。