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家禽被认为是沙门氏菌的主要宿主,乳酸菌通过粘附于宿主肠道上皮细胞表面竞争性排斥病原菌在宿主肠道内的定植,加强宿主的免疫调节应答从而有效地控制沙门氏菌对家禽的感染。此外,通过对乳酸菌的工程改造,使工程乳酸菌直接将抗炎分子递送到粘膜表面,能够有效地治疗由病原菌或者化学物质引起的炎症性疾病。本研究的目的是在常规筛菌指标(乳酸菌的耐酸耐胆盐、抑菌活性、粘附能力和抗粘附能力)的基础上,基于体外免疫调节活性筛选能够抵抗沙门氏菌对肉鸡感染的潜在益生菌,并且通过基因工程的方法改造乳酸菌,使其能够表达具有生物活性的家禽抗炎细胞因子IL-10。此外,通过原核表达及免疫兔子的方法制备家禽细胞因子LITAF、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12的多克隆抗体,为家禽免疫应答的进一步研究奠定基础。1.家禽细胞因子的原核表达及抗体的制备从肉鸡基因组中PCR克隆了LITAF、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12基因全长序列,同时选择pET-32a(+)或pET-21a(+)作为表达载体,设计限制性酶切位点为Kpn I和Hind III或BamH I和Hind III,将分别编码基因LITAF、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12抗原决定簇100、268、186、156和141个氨基酸残基的核苷酸片段连接至pET-32a(+)或pET-21a(+)上,经筛选获得阳性重组子pET-32a(+)-LITAF、pET-32a(+)-IL-1β、pET-32a(+)-IL-6、pET-32a(+)-IL-10和pET-21a(+)-IL-12;将阳性重组子转化至大肠杆菌BL21(DE3)或Transetta(DE3)感受态中,获得重组表达的基因工程菌。经IPTG诱导表达后,获得目标蛋白多肽。将目的蛋白纯化后免疫兔子,制备家禽细胞因子的多克隆抗体,可用于家禽细胞因子在蛋白水平上的检测。2.免疫调节活性和粘附性能泡菜乳酸菌的筛选及抵抗沙门氏菌的研究本文中,从发酵泡菜中共分离得到16株乳酸菌,并且该16株乳酸菌能够有效的在模拟的胃肠道环境中存活和抑制6种病原菌的生长。其中Lactobacillus rhamnosus P1、Lactobacillus plantarum P2、Lactobacillus rhamnosus P3和Lactobacillus casei P4具有较强的粘附于上皮细胞Caco-2的能力。此外,与其他三株乳酸菌相比,L.plantarum P2菌株能够更有效的诱导脾脏单核细胞表达细胞因子LITAF和IL-12,以及更有效的抑制肠炎沙门氏菌对上皮细胞Caco-2的粘附和侵染。这些结果表明L.plantarum P2菌株能够被用作益生菌的候选菌株而抵抗沙门氏菌对食物的感染。3.鸡源性肠道乳酸菌的筛选及对雏鸡感染沙门氏菌的保护作用在分离获得的101株乳酸菌中,有13株乳酸菌能够在酸性(pH 2.5)和不同胆盐浓度(0.1%~1.0%)的条件下存活,而且该13株乳酸菌还能够有效地抑制6种病原菌的生长和粘附于Caco-2细胞表面。然而,它们的免疫调节活性差异很大。最后,选择三株(Lactobacillus plantarum PZ01,Lactobacillus salivarius JM32和Pediococcus acidilactici JH231)免疫调节活性较强的菌株和三株(Enterococcus faecium JS11,Lactobacillus salivarius JK22和Lactobacillus salivarius JM2A1)免疫调节活性较弱的菌株,比较它们体外抑制沙门氏菌粘附和侵染Caco-2细胞的能力,以及它们的体内抗菌效果。与后面的三株菌相比较,前面的三株菌在体外抑制沙门氏菌对Caco-2细胞的粘附和侵染、减少沙门氏菌在肠道内容物、脾脏和肝脏中的数量,以及在病原菌感染试验中,降低血清中LITAF、IL-1β、IL-6和IL-12,以及增加IL-10表达水平均具有较好的效果。结果表明,乳酸菌的体外免疫调节活性可以作为额外的筛菌指标,用于筛选作为家禽饲料添加成分的更有效的益生菌。4.表达家禽抗炎细胞因子IL-10的工程乳酸菌的构建及其生物学活性的检测在构建的5株工程乳酸菌中,工程菌株L.casei P4-cIL-10具有最强表达cIL-10的能力,表达量为163.8 ng/ml,其次是L.casei LP1-cIL-10、L.rhamnosus P5-cIL-10和L.plantarum PZ01-1-cIL-10,工程菌株L.reuteri LY01-cIL-10检测不到cIL-10的表达。同时,培养的工程菌株L.plantarum PZ01-1-cIL-10、L.casei LP1-cIL-10、L.casei P4-cIL-10和L.rhamnosus P5-cIL-10的菌体部分在预测的成熟cIL-10的大小处能够检测到一条清晰的条带。此外,与野生型菌株和阳性对照组相比,工程乳酸菌株L.casei P4-cIL-10在24 h和48 h时均能有效地减少由LPS刺激肉鸡脾脏单核细胞后表达促炎细胞因子LITAF、IL-1β、IL-6和IL-12的水平,表明工程乳酸菌株L.casei P4-cIL-10比它的野生型菌株具有更好的保护作用。最后,与野生型菌株L.casei P4相比,工程乳酸菌株L.casei P4-cIL-10同样具有益生菌性能,包括能够在模拟的胃肠道环境中存活,具有抑菌活性、粘附能力、抗粘附及抗侵染的能力和免疫调节性能。这些结果表明工程乳酸菌株L.casei P4-cIL-10能作为益生菌的候选菌株。综上所述,本课题初步丰富了乳酸菌体外筛选的指标,并通过体内验证了乳酸菌的免疫调节活性在筛菌过程中的重要性。初步探索了工程乳酸菌在家禽中的应用。