人溶菌酶作为一种天然蛋白质,由于其具有抗菌消炎、防腐保鲜的功能,被广泛地应用于人们地生产生活中,但是从人体组织、器官中提取的人溶菌酶远远不能够满足人们的需要。因此,近年来,人们把目光投向了当前的基因工程技术,即利用原核或真核生物作为寄主细胞,来实现大规模生产人溶菌酶的目的。在此基础上,乳腺生物反应器的研究成为了当前生物技术领域的热点之一,而利用乳腺生物反应器生产生物活性蛋白的研究也迅速展开。本实验的目的在于为乳腺生物反应器提供转基因供体细胞,在以前的实验基础上,进行了以下研究工作:1.采用组织块贴壁法分离培养了牛耳皮肤成纤维细胞,脂质体转染法转染第四代成纤维细胞,载体为含绿色荧光蛋白和G418抗性基因双重筛选标记的人溶菌酶乳腺特异性表达载体pEBH。利用PCR和RT-PCR的方法鉴定了转基因阳性成纤维细胞中目的基因的表达,结果得到了阳性条带。说明此次转基因细胞可以作为转基因动物供体细胞。2.将以上转基因细胞用于核移植时,为了说明转基因细胞对核移植后的重构胚的发育影响,设计了不同的实验,得到了以下结果:(1)研究了基因转染对重构胚发育的影响。实验组以G418筛选4周的转基因细胞为供体细胞进行核移植,对照组为非转基因细胞。发现实验组重构胚与对照组相比,融合率,卵裂率没有显著差异,但囊胚发育率转基因组显著低于对照组(P<0.05),这说明基因转染及筛选过程对转基因重构胚的发育有不利的影响。(2)比较不同的转基因细胞挑选方法对转基因克隆胚发育及阳性率的影响。转染一周后发荧光的转基因细胞、筛选一个月细胞、筛选一月后发荧光的细胞用于核移植,三组细胞在融合率及卵裂率没有统计学上的显著差异,但对囊胚发育率及转基因囊胚阳性率有显著的影响。P<0.05(3)研究了绿色荧光蛋白在重构胚中的表达时间及其对胚胎后期发育的影响。8-16细胞开始表达荧光蛋白的重构胚的囊胚发育最高。