利用小分子化合物已成功实现了体细胞向诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的转变,经证实在该过程中产生了一种不可缺少的中间阶段细胞,即化学诱导胚外内胚层样细胞(chemical induced extraembryonic endoderm-like,ciXEN),它们在基因表达模式和分化潜能上与胚胎源性胚外内胚层细胞(embryo-derived extraembryonic endoderm,eXEN)极为相似。但是ciXEN细胞的其它生物学特性和小分子化合物对ciXEN细胞体外维持培养的影响还尚未有系统性报道。本研究以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)为起始细胞,利用小分子化合物组合,获得无外源基因整合的ciXEN细胞;通过基因组测序、qPCR分析、免疫荧光、悬滴培养和代谢模式分析等验证ciXEN细胞的生物学特性;此外,通过去除培养液中的小分子化合物和bFGF验证其对ciXEN细胞体外维持培养的影响。1.利用小分子化合物组合重编程MEFs获得ciXEN细胞不同数量起始细胞经小分子化合物组合的持续处理,发现细胞逐渐聚集成团并最终形成边缘清晰的克隆;对细胞克隆进行计数时发现以4×10~4个MEFs进行重编程时获得的细胞克隆数最多,基质胶能将克隆形成率提高31.47±3.86倍,且这些细胞克隆呈Sox17和Foxa2双阳性。挑取的细胞克隆重新贴壁后,从其中能长出大量上皮样细胞。小分子化合物组合消除了成纤维细胞相关基因表达而获得了胚外内胚层细胞基因表达谱,同时该过程伴随着间质上皮转化。ciXEN细胞产生过程中胚外内胚层标记物、上皮相关基因、Sox2和Cxcr4表达量增加,而间质标记基因和成纤维细胞相关基因的表达水平下降,且E-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平与其mRNA表达水平相一致。此外,该小分子化合物组合作用于小鼠新生成纤维细胞(mouse neonatal fibroblasts,MNFs)后,细胞聚集形成了排列松散的克隆,并证实3×10~4个MNFs是最适起始细胞密度;另外这些MNFs源性克隆亦呈Sox17和Foxa2双阳性。这些结果表明该小分子化合物组合能实现MEFs向ciXEN细胞的重编程,也适用于MNFs向ciXEN细胞重编程。2.ciXEN细胞生物学特性鉴定对细胞克隆中长出的上皮样细胞进行体外传代扩增,取第5代ciXEN细胞进行后续实验。形态学上,低密度时ciXEN细胞呈强折光性短梭形而高密度时ciXEN细胞则成上皮样。ciXEN细胞表面有微绒毛,其内部超微结构异于MEFs。对第5代ciXEN细胞的基因表达进行分析,发现ciXEN细胞的胚外内胚层标记基因、上皮标记基因、Sox2和Cxcr4的表达水平明显高于MEFs而成纤维细胞标记基因和间质基因的mRNA水平则显著低于MEFs,但不表达Nanog和Oct4。且ciXEN细胞中E-cadherin、Gata4、Foxa2、Sox17、Sox2和vimentin表达呈阳性而Oct4和Nanog表达呈阴性,这与western blot结果相一致。ciXEN细胞具有强增殖能力,能体外扩增至少30代并维持细胞核型稳定,低代次和高代次ciXEN细胞的形态保持不变。在基因表达上,它们维持着胚外内胚层标记物、上皮相关标记基因和Sox2的高水平表达,而不表达多潜能相关基因和成纤维细胞标记物。此外,ciXEN细胞不仅能体外经诱导分化为脏壁内胚层,还能自发分化为外胚层和内胚层源性细胞,尤其是能分化成功能性肝细胞。对ciXEN细胞的转录组进行深入分析时,发现ciXEN细胞的产生过程涉及细胞结构和功能的重塑,同时还伴随着能量代谢的重塑。然而经系列代谢相关分析发现ciXEN细胞不依赖糖酵解供能,且在小分子化合物组合重编程过程中添加促进糖酵解的PS48并未增加细胞克隆形成率。上述结果表明ciXEN细胞尚未达到多潜能阶段且保留一定间质记忆,具有高度增殖能力和向脏壁内胚层和功能性肝细胞分化的可塑性;此外ciXEN细胞的产生过程伴随着能量代谢的重塑,但细胞的代谢模式并未转变成糖酵解。3.研究小分子化合物和bFGF对ciXEN细胞体外培养的影响去除ciXEN细胞维持培养液中的小分子化合物和bFGF后,细胞形态呈圆形上皮样,且诱导胚外内胚层样(induced extraembryonic endoderm-like cells,iXEN)细胞仍维持胚外内胚层基因和上皮基因的高表达而不表达间质基因和成纤维细胞基因,这与免疫荧光结果和western blot结果达成一致。此外,去除小分子化合物和bFGF后培养的iXEN细胞仍能向功能性肝细胞分化。这些结果表明小分子化合物和bFGF不是ciXEN细胞体外维持培养所必不可少的成分。