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背景:金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)作为金黄色葡萄球菌产生的一种重要的外毒素,中毒剂量低,人的致吐剂量仅为0.4μg/kg,是胃肠道强有力的致病毒素。对 SEB摄取的剂量以及途径的不同,会导致不同的中毒效果,包括普通的食物中毒、急性和致死性呼吸衰竭以及毒素中毒性休克综合症等。近年来肠毒素污染造成的突发公共事件也一直困扰着人们,对人类健康、社会经济发展的威胁越来越大,造成的损失也越来越大。该毒素通过呼吸道、消化道等多种途径侵入人体致病。例如1999年的全国城运会上,51名运动员发生葡萄球菌肠毒素食物中毒,迫使部分比赛取消,2003年日本发生的葡萄球菌肠毒素污染牛奶事件,导致14889人中毒。此外SEB是美国已经公布装备的标准生物战剂之一,也是生物武器核查单上的失能性战剂。其没有传染性,主要以气溶胶的形式传播,而且制备简单、产量高、稳定性好很容易成为生物战和恐怖分子应用的工具。 目的:针对SEB中毒救治,目前国内外主要从两个方面进行救治药物研究:一是筛选 SEB拮抗肽类药物,二是从已上市或即将上市的小分子抗炎症化学药物中筛选有效的SEB中毒治疗性药物。这两类药物均可以减少细胞因子释放、减轻休克症状,治疗SEB的中毒效应。本文拟通过建立体内外筛选模型,以期筛选到疗效更好、毒性更低的SEB蛋白类和化学类救治药物。 内容:实验第一部分首先建立小鼠致死性休克模型,选择受试小分子化学药物甲泼尼龙在小鼠致死性休克体内模型中进行保护性实验,并进行体内外药效学评价。实验第二部分对获赠SEB受体类拮抗剂质粒,选取大肠杆菌进行目的蛋白表达纯化,通过ELISA分析该受体拮抗剂与SEB的亲合力,此外还对该质粒进行了结构改造,去除组氨酸标签并在大肠杆菌中表达。第三部分构建SEB受体拮抗剂的重组质粒,选择毕赤酵母表达系统对目的蛋白进行表达。 方法:实验第一部分建立脂多糖(LPS)增强SEB引起的小鼠中毒性休克模型,给BALb/c雄性小鼠腹腔注射SEB1μg/只4h后,注射 LPS175μg/只,并设置PBS空白组和LPS、SEB对照组,观察所有小鼠注射SEB后96小时的存活情况,每隔12小时观察一次。选取甲泼尼龙多个剂量(75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg)和不同给药时间(3.75h、4.25h、4.5h、5h)在该小鼠中毒休克模型中进行剂量-效应关系研究。在小鼠给予 SEB8h后取血,分离血清,通过ELISA方法检测药物抑制TNF-α, IL-1α及IFN-γ细胞因子的分泌。用Grahpad软件统计各组间各细胞因子含量及小鼠生存时间差异。同时进行体外药效学实验: 1、抑制细胞因子分泌实验:从健康人外周血中分离PBMC,加受试物共培养16h,ELISA检测培养上清中TNF-α, IL-1β及IFN-γ等炎症因子的含量。结果用Graphpad统计组间差异 2、抑制人T淋巴细胞增殖实验:从健康人外周血中分离PBMC,加或不加受试物与SEB共培养72h后,用Luminescent Cell Viability Assay检测细胞增殖情况,结果用Graphpad统计组间差异。 实验第二部分将获赠质粒转入大肠杆菌BL-21(DE3)中对目的蛋白进行表达,将表达产物溶解在8M尿素中进行变性,然后表达产物经过Ni柱亲和层析纯化,并在纯化完成后进行梯度复性,利用ELISA分析目的蛋白与SEB的结合能力,并利用纯化的包涵体蛋白制备了SEB受体蛋白的多克隆抗体,此外还对该质粒进行了去除组氨酸标签的改构。 实验第三部分设计引物,将目的基因片断进行PCR,与pPIC9k连接,并电转至毕赤酵母 KM71的感受态中,挑选阳性转化子,进行发酵表达,并对目的蛋白进行Western blot验证。 结果:实验第一部分在LPS增强SEB引起的小鼠中毒性休克模型中,联合给药组小鼠在12至48小时内出现中毒休克症状并在48小时后全部死亡。在甲泼尼龙救治小鼠SEB中毒休克的实验中,发现腹腔注射SEB后,注射75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12 mg/kg甲泼尼龙,其对小鼠的保护率分别为100％、80％、60％、40％与对照组比较存在显著性差异。腹腔注射SEB后,3.75h、4.25h、4.5h、5h分别注射25mg/kg甲泼尼龙,小鼠的存活率为90％、70％、60％、30％与对照组相比,3.75h、4.25h给药组有显著性差异。相比LPS和SEB联合注射对照组,甲泼尼龙救治组的中毒小鼠8h血清中的TNF-α、IFN-γ、IL-1α分别被抑制了60％、93％、95％相比对照组有显著性差异。体外实验发现不同浓度的甲泼尼龙与SEB共培养后,40μg/ml、4μg/ml、0.4μg/ml剂量组的PBMC培养上清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β的释放水平相比SEB对照组,存在显著性差异。同时,甲泼尼龙能够抑制SEB引起的T淋巴细胞增殖,400μg/ml、40μg/ml、4μg/ml剂量组与SEB对照组都有显著性差异。 实验第二部分中,SEB受体拮抗剂成功表达,通过ELISA检测该蛋白与SEB之间结合能力均可以达到ng/ml,去除组氨酸标签的SEB受体拮抗剂改构成功,并在大肠杆菌中表达。 实验第三部分中,SEB受体拮抗剂的目的片断与pPIC9K表达载体构建重组质粒构建成功,蛋白在毕赤酵母 KM71中成功表达,经 Western免疫印迹验证该蛋白为SEB受体拮抗剂。 结论:1、本实验筛选到甲泼尼龙在小鼠致死性休克体内模型中可对SEB致死起到显著保护作用,可显著降低SEB对TNF-α、IFN-γ、IL-1α炎症因子的诱导作用,体外可显著抑制人PBMC增殖和人TNF-α、IFN-γ、IL-1β等炎症因子的释放,可作为SEB救治药物的候选分子进行下一步研究。2、SEB受体拮抗剂蛋白可以和SEB产生特异性结合,结合能力可达 ng/ml,应进一步进行 SPR分析,验证是否与文献报导一致结合能力可达皮摩尔级,并进行活性检测。3、在毕赤酵母中成功表达该受体拮抗剂,为今后该蛋白进行SEB中毒的临床应用奠定了基础。