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各种原因造成的尿道狭窄、尿道缺损仍然是泌尿外科的难题之一,临床上多采用包皮皮瓣、阴囊皮瓣、口腔黏膜、结肠黏膜等来重建尿道,其中,口腔黏膜是近年来广泛应用的修复材料,尤其是舌粘膜,近年来在临床上被广泛应用且大量的临床结果表明修复效果良好。但口腔黏膜存在取材部位并发症、取材量受限等问题。组织工程技术的快速发展,为尿道重建提供了新的方法。本研究探讨应用脂肪于细胞、口腔上皮细胞复合小肠粘膜下层脱细胞基质构建组织工程口腔黏膜来重建尿道的可行性,以期为尿道的修复重建提供新的选择。全文共分四章: 第一章种子细胞的培养和鉴定 1、目的： 探讨犬脂肪干细胞(adipose derired stem cell,ADSC)、口腔上皮细胞(oralkeratinocyte,OK)分离、体外培养增殖及鉴定方法。 2、材料和方法： 应用胶原酶消化法分离培养犬ADSC,利用流式细胞仪检测细胞表面标志(CD29,CD34,CD44,CD45,CD90和CD105)。 应用DispaseⅡ分离犬口腔上皮层,胰酶消化分离获得犬OK,在i3T3滋养细胞培养基扩增,免疫荧光检测细胞AE1/AE3的表达,获得足量细胞后利用流式细胞仪检测细胞表面AE1/AE3的表达率。 3、结果： 原代培养2 d后可见ADSC贴壁生长,约5天左右细胞融合可达80-90％,可传代培养。显微镜下见ADSC呈纺锤形,少数有突起,为不规则状。流式细胞仪检测结果CD29、CD44、CD90、CD105的表达均成阳性,CD34、CD45表达为阴性。 OK原代培养3天后可见贴壁生长,约15天左右细胞融合达到80-90％。显微镜下见OK呈多角形,细胞融合后呈典型的“铺路右”状外观。传代后将P1 OK接种至丝裂霉素灭活的3T3(i3T3)培养基培养、扩增,可见OK细胞呈集落样生长,约6天细胞融合达90-95％。流式细胞仪检测P3 OK AE1/AE3表达率为89.2％。 4、结论： 利用胶原酶消化法可获得大量的ADSC,来源广泛,获取简单,并且创伤小。ADSC形态与成纤维细胞形态相似,均呈纺锤形,因此很难从形态上来区分两者。我们采用了流式细胞技术对ADSCI进行鉴定,结果表明CD29、CD44、CD90、CD105的表达均阳性,CD45、CD34表达为阴性。此结果与国内外报道ADSC表面标志相符。 DispaseⅡ能将犬口腔上皮表皮层脱离,将表皮层粉碎后用胰酶消化,能获得大量OK,方法简单,创伤小。OK呈扁平、多边形,形状不规则,细胞融合后呈典型的“铺路石”状外观。细胞生长缓慢,2-3代后即衰老变性。在i3T3培养基上,OK表现出旺盛的增殖力,细胞生长迅速,能保持7-8代稳定增殖。流式细胞检测表明,P3 OK中AE1/AE3表达率达到89.2％。 第二章体外共培养环境对ADSC,OK细胞移行速率、增殖速率的影响 1、目的： 通过检测ADSC和OK在体外共培养患者中的移行速率、增殖速率来评估二细胞的相容性。 2、方法： 将等量的ADSC和oK接种至同一个刻度培养皿中,观测共培养环境下细胞的移行速率,与单独培养环境下细胞移行速率作对比,探讨共培养环境对细胞移行速率的影响。 将ADSC和OK的培养上清分别加入对方的培养液中(条件培养基),行MTT检测,观测模拟共培养环境下细胞的增殖速率,与常规培养环境下细胞增殖速率作对比,探讨共培养环境对细胞增殖速率的影响。 3、结果： ADSC的移行速率由单独培养环境下的0.8-5.5mm/d提高至共培养环境下的0.8-6.8mm/d,OK的移行速率由单独培养环境下的0-1.5mm/d提高至共培养环境下的0.2-2.5mm/d。MTT法检测细胞的增殖速率表明,与常规培养环境相比,条件培养基培养环境下ADSC和OK的增殖速率均得以提高。 4、结论： 体外共培养环境下,ADSC和OK的移行速率均能得以明显提高。在模拟共培养环境的条件培养基培养环境下,ADSC和OK的增殖率也明显提高。ADSC和OK在体外共培养环境下呈现互相促进、协同增殖态势。 第三章小肠粘膜下层脱细胞基质(SIS)的制备、与ADSC和OK体外构建组织工程口腔粘膜的试验研究 1、目的： 探讨SIS的生物相容性,以及与ADsC和OK体外构建组织工程口腔粘膜的可行性。 2、方法： 将猪小肠清洗后,钝性去除粘膜层和浆肌层,获得小肠粘膜下层,以1％的Triton-X100与0.1％NH3H2O脱细胞,以1:1的甲醇/氯仿脱脂处理,反复冲洗后行冻干,密封包装后以25kGy的剂量行Co50辐照灭菌。将所得的SIS行旺染色、Masson染色观察有无细胞残留及胶原纤维形态,扫描电镜观察材料表面的纤维分布和表面特点。将SIS浸泡于DMEM培养液中1周,取浸泡DMEM液培养ADSC,绘制生长曲线,观测SIS浸泡液对细胞增殖速率的影响,以此评估SIS的生物相容性。 将ADSC种植到SIS上,3天后将ADSC-SIS翻转置于不锈钢网上,反面种植OK,用混合培养基在液-气平面培养OK-SIS-ADSC复合物7天,行扫描电镜观察细胞在支架上的生长,HE染色观察该组织工程复合物的组织学特点,与OK-SIS作对比,观察ADSC的存在对新生上皮的影响。 3、结果： HE染色和Masson染色表明所得SIS无细胞残留,保持完整的胶原纤维成分。扫描电镜下SIS表面胶原纤维呈现裂隙样结构,利于细胞的黏附、长入。MTT检测表明SIS浸泡液不对ADSC的增殖曲线产生影响,表明sIs生物相容性良好。 扫描电镜结果表明,ADSC和OK均能在SIS表面良好黏附、生长。HE染色表明,与OK-SIS对比,OK-SIS-ADSC复合物表面上皮层结构更为致密、更为厚,上皮层形态更好。 4、结论： SIS生物相容性良好,OK和ADSC均能在其表面良好生长。ADSC的存在利于体外培养环境下新上皮层的形成,利用SIS、OK和ADSC体外构建组织工程口腔黏膜是切实可行的。 第四章组织工程化OK-SIS-ADSC复合物用于犬尿道重建的实验研究 1、目的： 探讨组织工程化OK-SIS-ADSC复合物在尿道重建中的应用前景。 2、方法： 分别采用单纯的SIS及组织工程化OK-SIS-ADSC复合物对雌性Beagle犬行5cm长尿道黏膜替代修补,剥除5cm尿道黏膜后,将修复材料缝合于尿道床上,与两端正常尿道黏膜缝合,留置8号导尿管。术后3周拔除导尿管,在术后5、9、13、17、21、25周进行尿道造影,25周后行组织学检测。 3、结果： SIS重建尿道组术后5周尿道造影显示修复段发生尿道狭窄,该组1只犬在术后7周死于尿潴留继发感染。OK-SIS-ADSC复合物重建尿道组3只犬均良好成活至试验结束,各时间点尿道造影均显示修复段尿道保持通畅。术后25周取材组织学染色表明修复段形成复层上皮结构。 4、结论： 利用SIS、OK和ADSC构建组织工程化OK-SIS-ADSC复合物能够成功管状修复犬5cm长尿道粘膜缺损,单纯SIS管状修复5cm尿道缺损后会造成修复段尿道狭窄。