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背景与目的:肝纤维化是临床各种慢性肝病的共同病理基础和特征,肝脏细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡、导致ECM在肝内的过度沉积是肝纤维化发展的主要机制。目前关于肝纤维化的研究已达成共识:肝纤维化是可逆性病变,而肝硬化则不可逆转。因此阻止和延缓肝纤维化的发生、发展是治疗肝硬化的关键环节。研究发现在致肝纤维化的细胞因子中最重要有血小板衍化生长因子(PDGF)和转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β),其中TGF-β是最强有力的致纤维化细胞因子。近几年,肝纤维化中TGF-β的一般信号传导通路已基本阐明:首先活化了的TGF-β与II型TGF-β受体(TβRII)结合并使之磷酸化而具有激酶活性;与TGF-β结合的TβRII再结合I型TGF-β受体(TβRI)形成I、II型受体复合物,并使TβRI磷酸化具有激酶活性;最后,激活的TβRI激活酶磷酸化其特殊的受体Smads (R-Smads) ,从而调节肝星形细胞(HSC)的转化和ECM的合成、降解。即TGF-β发挥作用必须借助其在细胞膜上的跨膜受体,TβRI和TβRII。故从理论上,可推测选择性抑制TβRI的表达,应可影响TGF-β信号传导,从而抑制TGF-β的促纤维化作用。在正常肝脏中,基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotei-nases,MMPs)与基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metallopropteinases,TIMPs)处于动态平衡的状态,维持胶原的产生与降解之间的平衡。当有损伤因子作用于肝脏,使HSC活化,打破了MMPs与TIMPs的平衡,就会导致胶原纤维降解的减少,致使大量的胶原在肝组织中沉积。肝内主要存在的TIMPs有TIMP-1和TIMP-2,其中以TIMP-1表达更为显著;主要存在的MMPs在人类为MMP-1,在啮齿类动物为MMP-13;TIMP-1可与MMP-1/MMP-13特异性结合,抑制其活性。故推测,抑制TIMP-1的表达,可减轻TIMP-1对MMP-1/MMP-13的抑制作用,增加ECM的降解,减少ECM的沉积,延缓肝纤维化的发生、发展。我们应用重组DNA技术构建反义TβRI真核细胞表达质粒和反义TIMP-1真核细胞表达质粒,导入大鼠肝纤维化模型中。一方面,通过选择性抑制TβRI的表达,调节TGF-β信号传导,从而抑制TGF-β的促纤维化作用;另一方面通过抑制TIMP-1的表达,减轻TIMP-1对MMP13的抑制作用,提高MMP13的活性,减少ECM的沉积,最终同时在两个环节上干预肝纤维化的发生、发展。材料和方法:1.反义质粒的构建和鉴定:取-80℃冰冻保存的大鼠肝组织,应用TRIzol法提取总RNA,15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度。使用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的基因TβRI cDNA片段,采用巢式PCR扩增TβRI基因片断。用Cacl2法诱导感受态细胞。将纯化回收的pcDNA3.1(+)线性化载体和TβRI基因片段定向及反向连接,构建以pcDNA3.1(+)为载体的反义TβRI基因真核表达质粒。转化JM109大肠杆菌。酶切证实的阳性克隆行测序分析。2.大鼠肝纤维化模型制备及质粒导入:有效进入实验的大鼠90只。实验大鼠随机分为6组:反义TβRI治疗组(A组)、反义TβRI+反义TIMP-1治疗组(B组)、反义TIMP-1治疗组(C组)、pcDNA3.1(+)空质粒对照组(D组)、模型对照组(M组)、正常对照组(N组)。每组15只。采用四氯化碳复合法制