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硫酸软骨素（Chondroitin sulfate,CS）是一类由葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid,GlcA）和N-乙酰基半乳糖胺（N-acetylgalactosamine,GalNAc）交替连接而成的酸性直链多糖。临床上,CS为防治关节病和修复受损的中枢神经系统的最佳药物,同时广泛地应用于食品、化妆品领域。但CS的应用范围随着它的结构不同,应用领域也不尽相同。其中硫酸软骨素A（Chondroitin sulfate A,CSA）和硫酸软骨素C（Chondroitin sulfate C,CSC）等主要用于治疗骨关节炎。因此制备结构单一的CS对其临床应用和新功能的开发尤为重要。前期研究表明,体外酶法催化能制备结构单一的CS,其中软骨素-4-O-磺基转移酶-1（Chondroitin-4-O-sulfotransferase-1,C4ST-1,EC 2.8.2.5）催化硫酸基团转移至软骨素的GalNAc 4位羟基,形成CSA。本文在E.coli BL21（DE3）和P.pastoris GS115中对前期研究过程中C4ST-1的表达量低而不能应用于临床生产,进行表达量的优化。在E.coli BL21（DE3）中通过融合策略考察不同融合标签和两种伴侣分子巯基氧化酶（Erv1p）和二硫键异构酶（DsbC）对C4ST-1在E.coli BL21（DE3）中可溶性表达的影响。在P.pastoris GS115中考察了可溶性标签、不同的信号肽及组成型启动子对C4ST-1表达的影响。本论文的主要结论如下:（1）基于N端融合策略和共表达Erv1p和DsbC提高C4ST-1在E.coli BL21（DE3）中的可溶性表达。利用DNA重组技术将三种蛋白标签（麦芽糖融合蛋白（Maltose binding protein,MBP）,小泛素样蛋白（Small ubiquitin-related modifier,SUMO）,硫氧还蛋白（Thiredoxin,TrxA））与C4ST-1在E.coli BL21（DE3）中进行融合表达,结果表明N端融合Trx A的重组菌株酶活性最高,为9.78±0.45 U·L-1。为进一步提高胞内可溶性蛋白的表达水平,共表达催化二硫键从头形成的Erv1p或/和促进二硫键正确折叠的DsbC。结果表明共表达DsbC可显著提高胞内可溶性蛋白表达水平,但共表达Erv1p对胞内C4ST-1的表达影响相对较小。C4ST-1和Erv1P或DsbC共表达菌株的酶活分别为原始菌株的1.30和2.33倍,活力达到12.32±0.76 U·L-1和21.99±0.42 U·L-1。同时共表达Erv1p和DsbC的菌株进行摇瓶水平和3 L发酵罐放大培养,酶活分别达到29.12±0.66 U·L-1和49.97±0.73 U·L-1。（2）优化启动子提高C4ST-1在P.pastoris GS115中的组成型表达。基于Gibson组装策略将四个组成型启动子基因（PGAP、PPGK1、PTEF1、PGCW14）,分别与删除PAOX1的线性化载体pPIC9K-α-SUMO-C4ST-1整合构建C4ST-1组成型表达框。在四种组成型启动子作用下,重组P.pastoris GS115菌株均实现了C4ST-1的活性表达,其中在PTEF1的作用下,C4ST-1的表达量最高,酶活达到50.70±0.51 U·L-1。（3）基于N端优化策略和培养条件优化提高C4ST-1在P.pastoris GS115中的分泌表达。为了增加其分泌表达水平,比较研究了两种蛋白标签（SUMO,Trx A）和七种信号肽（α,α（△57-70））,α（VAVE）,SUC2,P18,nsB,PHO1)的差异。结果表明,C4ST-1的N端融合SUMO标签并在信号肽α的KEX2酶切割位点后插入氨基酸序列VAVE后,C4ST-1的细胞外酶活性从7.07±0.30 U·L-1增加到43.05±0.31 U·L-1;通过摇瓶诱导条件优化,C4ST-1的酶活达到了62.00±0.58 U·L-1,是优化前的1.42倍;进一步通过3L发酵罐进行高密度发酵,C4ST-1酶活达到189.00±2.08 U·L-1。