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背景与目的胸腺作为主要的淋巴器官,是T淋巴细胞发育和成熟的部位。胸腺是机体第一个经历年龄相关性退化的器官,胸腺退化主要由胸腺上皮细胞（Thymic epithelial cell,TECs）数量减少、功能紊乱而引起的,表现为胸腺体积减小,组织结构紊乱,脂肪细胞增加,记忆T细胞比例增加,以及幼稚T细胞输出减少,机体免疫功能受损等。胸腺退化会导致免疫缺陷,增加机体患癌症以及感染性相关疾病的可能性。因此,预防胸腺退化以及重建胸腺结构及功能可能有助于促进人外周T细胞库的重塑,维持和改善T细胞介导的免疫稳态。D-半乳糖（D-galactose,D-gal）诱导的加速衰老小鼠模型已被广泛应用在衰老相关领域研究中。二甲双胍（Metformin,Met）作为胰岛素增敏剂,在临床上是治疗二型糖尿病的一线药物,其已被证明能延长小鼠寿命,但作用机制尚不清楚。在本研究中,我们在D-gal加速衰老以及自然衰老小鼠中,探讨Met添加对D-gal诱导的小鼠胸腺退化和自然衰老小鼠胸腺退化是否具有保护作用,以及Met是否通过促进TECs的再生、调节胸腺线粒体平衡对胸腺退化发挥保护作用,并探究了Met最合适的剂量。本研究最终期望为进一步探索胸腺退化与再生的相关机制以及为Met改善胸腺功能,延缓衰老提供理论依据。方法1.实验动物分组（1）D-gal加速衰老小鼠:2月龄昆明雌鼠共40只,随机分为4组,每组各10只,分为:Control组,D-gal组,Met 1组和Met 2组。Control组每天腹腔注射0.9%Na Cl,持续8周;D-gal组、Met 1组和Met 2组前两周每天腹腔注射120mg/kg D-gal,从第3周开始,D-gal组每天腹腔注射120mg/kg D-gal,并灌胃0.9%Na Cl,Met 1组和Met 2组每天腹腔注射120mg/kg D-gal,并分别灌胃100mg/kg和300mg/kg Met,持续6周。（2）自然衰老小鼠:9月龄昆明雌鼠共16只随机分为2组,每组各8只,分为:Control组,Met组。对照组每天灌胃0.9%Na Cl持续6周,Met组灌胃100mg/kg Met持续6周。建模结束后,取小鼠胸腺组织并称重记录。2.胸腺组织学分析和流式细胞检测（1）石蜡切片,HE染色观察胸腺组织的结构变化;（2）胸腺衰老相关指标检测:冰冻切片,衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence associated-β-galactosidase,SA-β-Gal）染色,检测胸腺组织中衰老细胞的变化;天狼星红染色,检测胸腺组织中胶原纤维的沉积情况;（3）流式细胞术:研磨胸腺组织,分离胸腺细胞,分析胸腺细胞亚群（CD4+CD8-,CD4-CD8+,CD4+/CD8+）的变化;（4）免疫组织化学方法检测TECs转录因子叉头蛋白N1（Forkhead protein N1,Fox N1）,自身免疫调节因子（autoimmune regulator,Aire）,干细胞转录因子SRY相关的HMG框基因2（SRY-Related HMG-Box Gene 2,Sox2）、同源异域框转录因子Nanog（Homeobox Transcription Factor Nanog）的定位和表达;双重荧光免疫组化染色,检测上皮角蛋白8（keratin 8,K8）、Sox2的表达。3.胸腺组织线粒体功能检测（1）荧光酶标仪检测小鼠胸腺组织中线粒体膜电位、活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平的变化;（2）酶标仪检测小鼠胸腺组织中氧化应激指标超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的水平,生物分光光度检测小鼠胸腺组织中丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的水平;（3）Western blot检测小鼠胸腺组织线粒体动力学相关蛋白—动力相关蛋白1（dynamin-relatedprotein 1,Drp1）、线粒体融合蛋白1（Mitofusin1,Mfn1）以及线粒体融合蛋白2（Mitofusin2,Mfn2）的表达。4.转录组测序分析提取胸腺组织总RNA,RNA测序,分析Met组和D-gal组小鼠胸腺差异基因,并对差异基因进行GO注释与富集分析、KEGG注释与富集分析。结果1.Met对D-gal加速衰老小鼠胸腺的影响1.1胸腺组织学和细胞亚群的变化（1）与Control组和Met组相比,D-gal组小鼠胸腺体积缩小,胸腺指数下降,且D-gal组小鼠胸腺皮质变薄,皮髓质境界不清,Control组和Met组小鼠胸腺皮质增厚,皮髓质境界清晰;（2）与Control组和Met组相比,D-gal组小鼠胸腺中衰老细胞增多,胶原纤维出现明显沉积。Met给药能减少胸腺中衰老细胞的数量以及胶原纤维的沉积;（3）流式细胞术结果显示,D-gal组小鼠胸腺CD4+CD8-T细胞百分比下降,CD4-CD8+T细胞百分比升高,且CD4+/CD8+T细胞比值降低,而Met给药能够恢复T细胞亚群紊乱的现象;（4）免疫组化结果显示,D-gal组小鼠胸腺组织中Fox N1、Aire以及Sox2、Nanog的表达明显减少,Met给药后,这几个标记物的表达量升高,且双重荧光免疫组化结果表明胸腺中TECs包含具有干性特征的细胞类群。1.2胸腺组织中线粒体功能的变化（1）D-gal组小鼠胸腺组织中ROS生成增多,线粒体膜电位明显下降,给药后,Met能降低ROS的生成,提高胸腺线粒体膜电位水平;（2）D-gal组小鼠胸腺组织中SOD水平降低,MDA含量明显升高,给药后,Met能提高SOD水平以及降低MDA水平;（3）Western blot结果显示,D-gal组小鼠胸腺组织中Drp1表达明显下降,然而Mfn1以及Mfn2的表达无差异,Met给药后能提高Drp1的表达,且Mfn1及Mfn2的表达无统计学意义上的差异,Met给药能恢复线粒体融合和分裂平衡。1.3转录组测序分析结果RNA测序结果表明,Met组与D-gal组小鼠胸腺中共有2601个差异基因,其中1218个基因上调,1383个基因下调。且Met组与D-gal组差异基因通过GO富集和KEGG富集较高的主要与线粒体功能有关。2.Met对自然衰老小鼠胸腺的影响2.1胸腺组织学的变化:（1）9月龄小鼠Met给药6周后,与Control组（10.5月龄）相比,胸腺体积明显增大,胸腺指数增高;Control组小鼠胸腺皮质变薄,皮髓质境界不清,胸腺结构紊乱。Met给药后胸腺皮质变厚,胸腺结构的紊乱得以恢复;（2）Control组小鼠胸腺中衰老细胞增加,胶原纤维的沉积明显;Met给药后小鼠胸腺中衰老细胞与对照组相比明显降低,且Met减少了小鼠胸腺中胶原纤维的沉积;（3）免疫组化结果表明,Control组小鼠胸腺中Fox N1、Aire以及Sox2、Nanog的表达降低,Met给药后,它们的表达明显升高。2.2胸腺组织线粒体功能的变化（1）Met给药6周后,与Control组相比,小鼠胸腺组织中ROS水平降低,且线粒体膜电位水平明显高于Control组;（2）与Control相比,Met组小鼠氧化应激指标MDA的水平明显下降,SOD的水平升高;（3）Western blot结果显示,Met给药组小鼠胸腺中Drp1的表达高于Control组,然而Mfn1和Mfn2的表达无统计学意义上的差异,Met给药能够恢复自然衰老小鼠胸腺中的线粒体平衡。结论:二甲双胍对D-半乳糖诱导的胸腺退化以及自然衰老的小鼠胸腺退化具有保护作用;其机制可能是通过促进胸腺上皮细胞的再生、调节胸腺线粒体功能来改善胸腺结构,延缓胸腺衰老。