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近年来,由禽流感病毒引起的流感疫情在全球各地大规模爆发。高致病性禽流感不仅能使禽类大批量死亡,而且还能感染人类引发严重的呼吸道疾病。低致病性禽流感会引起家禽患病、产蛋量下降甚至死亡。因此爆发禽流感疫情将导致严重的经济损失,严重威胁人类生命健康。随着我国家禽养殖业不断发展,养殖规模不断扩大,H9N2型禽流感爆发将带来严重的经济损失。H5N1型禽流感病毒致病能力强,能使人类和家禽均患病且死亡率高,已然成为全球公共卫生关注的焦点。目前,我国防治禽流感疫情主要依靠疫苗免疫接种。市场上销售的禽流感疫苗主要以灭活疫苗为主,但该疫苗存在返毒风险及灭活剂等缺点,无法应对禽流感疫情的爆发。因此研制出高效安全的流感疫苗越来越受到关注。由于VLP不含有病毒核酸,无致病性,且其表面具有抗原成分,是新型疫苗研究的热点。目前,我国尚未出现用于预防H5N1、H9N2型禽流感的VLP疫苗。基于以上问题,本课题将研制出三种不同佐剂类型的流感H5N1/H9N2型二价VLP疫苗,并从免疫方面验证二价VLP疫苗的免疫效果。研究目的:本研究利用杆状病毒表达系统制备H5N1 VLP和H9N2 VLP,以脂质体、白油及壳聚糖微球为佐剂,研制出三种不同佐剂的二价VLP疫苗。对VLP疫苗进行动物免疫效果评价,筛选出免疫原性强、安全及长效的流感H5N1/H9N2型二价VLP疫苗。研究方法:通过对H5N1和H9N2重组杆状病毒P1代进行增殖及TCID50测定,Western Blot检测VLP中HA、M1蛋白的特异性,并用ELISA和血球凝集实验分别测定VLP中HA含量及其血凝效价。其次采用薄膜冻融法制备脂质体,通过单因素和正交实验筛选出脂质体制备的最佳工艺,研制出二价脂质体VLP疫苗,并对脂质体的包封率、物理稳定性、剩余水分和安全性等检验。拟用白油及微球佐剂制备出二价VLP油乳佐剂疫苗、二价微球VLP疫苗,并对二价VLP疫苗进行相关质量安全评价及安全试验。最后通过动物免疫实验检测二价VLP疫苗特异性抗体水平。研究结果:1.通过Western Blot鉴定、HA定量ELISA及血球凝集实验检测两种VLP。结果表明,H5N1和H9N2 VLP均出现特异性条带,HA含量分别为134.42±4.78μg/m L、129.73±4.20μg/mL。具有较高的免疫原性,可作为二价VLP疫苗的原料。2.制备的二价VLP疫苗脂质体的包封率为83.37%,真空烘干法测得的脂质体冻干粉剩余水分为2.5%,4℃低温保存120天后其包封率达60.78%。油乳佐剂疫苗的稳定性常数为95.5%,二价微球VLP疫苗的体外释放度达83.1%。3.免疫SPF鸡28d后,脂质体组抗H5N1抗体及抗H9N2抗体的HI滴度分别为9.28Log2、9.43Log2,均显著高于油乳和微球实验组的抗体滴度(p<0.01);除脂质体组外,其它各实验组中和H5N1、H9N2病毒的抗体滴度均显著低于灭活疫苗组(p<0.01),而脂质体组中和H5N1、H9N2病毒的中和价分别为1/97、1/103,显著高于油乳及微球实验组(p<0.01);T淋巴细胞增殖实验结果表明,免疫28d后脂质体组的SI指数与灭活疫苗组无显著差异,且显著高于微球及油乳实验组(p<0.01),免疫56d后脂质体组的SI指数均高于微球及油乳实验组(p<0.01),H5N1病毒、H9N2病毒刺激脂质体组T淋巴细胞增殖的SI指数分别为4.29、5.65,能引起有效的细胞免疫应答。研究结论:本课题初步研制的二价脂质体VLP疫苗,免疫动物后能诱导产生较好的体液及细胞免疫应答,能为VLP疫苗的研制提供一个参考。