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先天免疫(innate immunity)是个体出生时就具备的,其机制主要是通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)来识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP),是个体抵抗病原体入侵的第一道防线。自2008年以来,干扰素刺激因子STING(Stimulator of Interferon genes)(又名MITA、ERIS或MPYS)诱导Ⅰ型干扰素产生的先天免疫应答机制的研究引起了广大关注。研究证实:STING是宿主感知病毒核酸继而产生Ⅰ型干扰素反应的信号接头分子,在先天免疫中起至关重要的作用。
目前,对STING的研究主要集中在人和小鼠等哺乳动物上,其在家禽先天免疫上的作用鲜有研究报道,为此,设计并实施了一系列试验去探究STING在家禽抗病毒免疫过程中的功能。本试验首先克隆了鸡STING基因的mRNA全长,并对其进行了生物信息学和核苷酸多态性(SNP)分析;探究了鸡STING(chSTING)基因与其他动物STING基因的序列和结构异同;然后利用qRT-RCR技术检测chSTING基因在鸡心、肝、肺、脾、胸腺、法氏囊等11个组织中的表达情况;其次选用SPF鸡进行了机体NDV攻毒试验,检测了机体在抗病毒过程中chSTING及其下游基因的表达情况;最后分别转染NDV、Poly(dA∶dT)和Poly(I∶C)进入鸡胚成纤维细胞(CEFs),通过qRT-RCR技术检测chSTING及其下游基因IRF7、IFNα和IFNβ的表达情况,更深一步探究了chSTING在先天抗病毒免疫应答过程中的作用。由上述一系列试验,得出以下主要结论:
(1)chSTING基因的mRNA全长为1341bp,编码379个氨基酸。多序列比对显示,chSTING基因与其他鸟类的相似性较与哺乳动物的相似性高(鸟类60%,哺乳动物40%)。
(2)通过对四个不同品种鸡(每个品种30只)的chSTING进行SNP分析,发现:在四个品种中,罗曼粉蛋鸡STING基因的多态性最低,选育程度最高。
(3)chSTING基因在已检测的组织中广泛表达,在免疫组织(脾、胸腺和法氏囊)中表达最为丰富,但在肌肉组织(胸肌和腿肌)中几乎不表达。
(4)NDV感染的SPF鸡的chSTING在脾脏、胸腺和法氏囊的表达量均显著上升。
(5)NDV刺激的鸡胚成纤维细胞中,chSTING及其下游基因IRF7、IFNα和IFNβ的表达量随时间的增加而呈现上调趋势,而IFNα的表达量则呈现先升后降趋势;随着病毒滴度的增加chSTING及其下游基因的表达量呈现上调趋势。
(6)Poly(dA∶dT)刺激的鸡胚成纤维细胞chSTING及其下游基因IRF7、IFNα和IFNβ显著表达;Poly(dA∶dT)=2μg/ml时为最佳表达浓度,在同一浓度时,随着时间的递增,chSTING及其下游基因的表达量呈现逐渐上调趋势。
(7)Poly(I∶C)刺激的鸡胚成纤维细胞chSTING及其下游基因IRF7、IFNα和IFNβ显著表达;Poly(I∶C)=1tg/ml时为最佳表达浓度,在同一浓度时,随着时间的递增,chSTING的表达量呈现逐渐上调趋势。而其下游基因的表达量则呈现先升后降趋势。
目前,对STING的研究主要集中在人和小鼠等哺乳动物上,其在家禽先天免疫上的作用鲜有研究报道,为此,设计并实施了一系列试验去探究STING在家禽抗病毒免疫过程中的功能。本试验首先克隆了鸡STING基因的mRNA全长,并对其进行了生物信息学和核苷酸多态性(SNP)分析;探究了鸡STING(chSTING)基因与其他动物STING基因的序列和结构异同;然后利用qRT-RCR技术检测chSTING基因在鸡心、肝、肺、脾、胸腺、法氏囊等11个组织中的表达情况;其次选用SPF鸡进行了机体NDV攻毒试验,检测了机体在抗病毒过程中chSTING及其下游基因的表达情况;最后分别转染NDV、Poly(dA∶dT)和Poly(I∶C)进入鸡胚成纤维细胞(CEFs),通过qRT-RCR技术检测chSTING及其下游基因IRF7、IFNα和IFNβ的表达情况,更深一步探究了chSTING在先天抗病毒免疫应答过程中的作用。由上述一系列试验,得出以下主要结论:
(1)chSTING基因的mRNA全长为1341bp,编码379个氨基酸。多序列比对显示,chSTING基因与其他鸟类的相似性较与哺乳动物的相似性高(鸟类60%,哺乳动物40%)。
(2)通过对四个不同品种鸡(每个品种30只)的chSTING进行SNP分析,发现:在四个品种中,罗曼粉蛋鸡STING基因的多态性最低,选育程度最高。
(3)chSTING基因在已检测的组织中广泛表达,在免疫组织(脾、胸腺和法氏囊)中表达最为丰富,但在肌肉组织(胸肌和腿肌)中几乎不表达。
(4)NDV感染的SPF鸡的chSTING在脾脏、胸腺和法氏囊的表达量均显著上升。
(5)NDV刺激的鸡胚成纤维细胞中,chSTING及其下游基因IRF7、IFNα和IFNβ的表达量随时间的增加而呈现上调趋势,而IFNα的表达量则呈现先升后降趋势;随着病毒滴度的增加chSTING及其下游基因的表达量呈现上调趋势。
(6)Poly(dA∶dT)刺激的鸡胚成纤维细胞chSTING及其下游基因IRF7、IFNα和IFNβ显著表达;Poly(dA∶dT)=2μg/ml时为最佳表达浓度,在同一浓度时,随着时间的递增,chSTING及其下游基因的表达量呈现逐渐上调趋势。
(7)Poly(I∶C)刺激的鸡胚成纤维细胞chSTING及其下游基因IRF7、IFNα和IFNβ显著表达;Poly(I∶C)=1tg/ml时为最佳表达浓度,在同一浓度时,随着时间的递增,chSTING的表达量呈现逐渐上调趋势。而其下游基因的表达量则呈现先升后降趋势。