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世界卫生组织已明确定义正常育龄夫妇有一年以上的未采取避孕措施且有规律性生活而仍没有受孕的即可诊为不育(Infertility),其中由男性方面的因素引起的不育症约占40%,称为男性不育症。男性不育的主要原因是精子数量少、精子畸形率高和活力低。相关研究发现男性精子质量的下降与精液中活性氧簇(ROS)的含量有密切关系,过量的ROS会导致精子的氧化应激,进而导致精子异常,引起男性不育。有研究表明,一些中药可以通过减少ROS而有效的保护精子免受氧化损伤的破坏,故对中药抗氧化活性成分的研究具有重要的现实意义。本论文提出了一种通过显微拉曼光谱技术快速、可靠的筛选对人精子有抗氧化作用的中药有效成分的方法。 主要内容如下所述: 1.巴戟天低聚糖的提取纯化。使用热回流法提取中药巴戟天的成分,用离子交换树脂纯化得到巴戟天低聚糖。高效液相色谱(HPLC)检测分析结果表明,提取纯化得到的巴戟天低聚糖纯度较高,可以用于后续的实验研究。 2.Fentons试剂诱导人精子氧化损伤模型的建立。研究了不同浓度Fentons试剂和不同孵育时间对精子DNA的损伤程度,通过精子染色质结构分析法检测了精子的DNA碎片指数(DFI),结果DFI随Fentons试剂浓度和孵育时间的增加而增高,30 min之后DFI趋于平衡,从而筛选出30% Fentons试剂与精子作用30min为最佳反应条件。另外通过检测不同浓度Fentons试剂组精子的氧化应激指标,也进一步证实了Fentons试剂可以引起精子的氧化损伤。 3.利用拉曼光谱研究中药的活性成分(巴戟天低聚糖、肉苁蓉苯乙醇苷、淫羊藿苷、梓醇)对人精子氧化损伤的保护作用。使用试剂盒检测各处理组精子的超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,结果模型组的SOD活性、GSH-Px活性明显低于正常组,而MDA含量明显高于正常组,所有浓度的药物组均能减少损伤精子细胞MDA的生成,提高SOD及GSH-Px活性;使用拉曼光谱分析,模型组精子的顶体、DNA及线粒体的拉曼光谱与正常组不同,进一步的主成分分析(PCA)结果证实了这一点。比较各实验组的拉曼光谱,与模型组相比,药物组拉曼光谱更为接近正常组,与酶活性的检测结果相一致。结果表明上述中药活性成分对精子的氧化损伤具有保护作用。 本实验针对男性精子氧化应激的问题,基于传统技术筛选出具有抗氧化作用的中药有效成分,采用拉曼光谱技术进一步分析检测,以探讨这一技术在中药有效成分筛选中的可行性,结果表明拉曼光谱技术作为一种快速、简单、无损分析技术,可为从中药中筛选精子抗氧化有效成分提供一种新的方法。