研究背景:以PD-1/PD-L1单抗为代表的免疫检查点抑制剂疗法是近几年来肿瘤治疗领域最成功的方法之一,目前已被NCCN、ESMO指南等各大国际指南推荐为非小细胞肺癌（NSCLC）一线治疗的优先推荐方案。但是该疗法在NSCLC中的单药疗效并不高,相当一部分患者出现原发性耐药或很快出现继发性耐药。中医学认为肺癌属于“肺积”、“徵积”等范畴,《内经》提出“肺与大肠相表里”观点,指出“宣降肺脏之气以疏肠腑之壅滞,调畅肠腑气机亦可清肺脏之浊毒”的治疗观。而肠道菌群被证实可以影响PD-1单抗的疗效。因此,尝试通过中医药调控肠道菌群以增加PD-1单抗的敏感性可能是解决该临床问题的一个方向。研究目的:现代药理学研究已发现温下方多种成分可调节肠道菌群,本研究拟分析肠道菌群与免疫检查点抑制剂疗效的相关性,探索应用温下方通过调整肠道菌群实现增效PD-1单抗,并分析其中的增效机制。研究方法:1.首先从临床队列入组75例拟接受PD-1单抗治疗的晚期非小细胞肺癌患者;在基线状态、PD-1单抗治疗过程中收集粪便,基于Illumina Mi Seq平台采用16s r RNA测序方法对物种进行鉴定,分析肠道菌群与PD-1单抗的疗效相关性,寻找与PD-1单抗疗效相关的菌群因素。2.收集临床队列患者的外周血、小活检组织标本,分析PD-1单抗疗效相关特征菌群、菌群多样性等与机体免疫和肿瘤免疫微环境的关系。3.基础实验部分:通过粪菌移植方式建立稳定菌群人源化小鼠模型,模拟临床上PD-1单抗无效患者的肠道微生态环境;基于已经建立的稳定菌群人源化小鼠模型,梯度温下方干预,观测各组移植瘤对PD-1单抗的反应情况,并检测小鼠外周血和肿瘤微环境中肿瘤免疫相关细胞因子、免疫细胞的变化,以探索其免疫增效机制。研究结果:1.NSCLC患者肠道菌群与PD-1单抗疗效相关性密切相关,是一种具有潜在价值的生物标志物。PD-1单抗有效组和无效组的肠道菌群在物种多样性、菌群丰度方面存在显著差异。亚组分析显示部分缓解（PR）患者和疾病进展患者（PD）患者之间的菌群多样性差异显著,而PR患者与疾病稳定（SD）患者之间、SD患者与PD患者之间菌群多样性差异不显著。根据多样性计算公式并结合丰度分析发现:两组之间不同的菌群特征表现主要是由稀有低丰度菌群在两组间分布不均衡造成。有效组肠道菌群α多样性比无效显著增高,更高的肠道菌群α多样性可带来更高的PD-1单抗反应率和更长的PFS。ROC曲线和COX回归分析显示:肠道菌群α多样性（Shannon指数）是PFS的独立预后因素。β多样性分析显示两组之间的分类聚集效应并不明显,提示两组菌群组成结构总体相似;但是基于Uni Frac距离的ANOSIM/PERMANOVA组间差异统计分析结果显示:加权ANOSIM/PERMANOVA分析显示两组之间无统计学差异,而非加权ANOSIM/PERMANOVA分析显示两组β多样性之间存在统计学差异;以上结果提示:PD-1单抗治疗有效组和无效组之间的菌群组成总体相似,但是也存在不同,而这种不同主要是由稀有低丰度菌群导致。PD-1单抗有效组特有物种为776种,无效组特有物种为428种,两组的共有物种为504种。菌群丰度分析发现:在“属”分类水平上,Desulfovibrio,Bifidobacterium,Anaerostipes,Faecalibacterium和Alistipes菌在有效组富集,而Fusobacterium菌在无效组富集;以上菌种除了Desulfovibrio外都对PD-1单抗的疗效具有一定的预测价值;以上结果提示:肠道菌群是一种具有潜在预测PD-1单抗疗效价值的生物标志物。患者PS评分、饮酒量和BMI是影响菌群在有效组和无效组之间分布的重要因素;更好的体力状态、更年轻的年龄、更少的吸烟量、更少的饮酒量似乎能提高在PD-1单抗有效组富集的菌群的丰度、减少在PD-1单抗无效组富集的菌群的丰度。肠道菌群α多样性和菌群丰度在整个PD-1单抗治疗过程中保持相对稳定,是一种相对稳定的生物标志物。2.PD-1单抗疗效相关的菌群丰度、菌群多样性与机体免疫密切相关。高肠道菌群α多样性（Shannon指数）组患者的外周血DC1细胞、Th1细胞、IFN-γ、IL-12水平和肿瘤组织中CD8+T细胞密度比低多样性组显著增高;对于Bifidobacterium,高丰度组患者的外周血中DC1细胞、Th1细胞、IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10水平和肿瘤组织中Th1细胞、CD8+T细胞密度比低丰度组显著增高;在肿瘤组织中,高丰度Bifidobacterium组（Foxp3+）Treg细胞密度显著降低;对于Alitipes,高丰度组外周血中IFN-γ、TNF-α水平和肿瘤组织中CD8+T密度比低丰度组显著增高。对于Faecalibacterium,高丰度组外周血中DC1细胞、IFN-γ、IL-12和肿瘤组织中CD8+T细胞比低丰度组显著增高;对于Fusobacterium,高丰度组患者外周血中IFN-γ、TNF-α水平显著高于低丰度组。未发现在有效组和无效组富集的菌群的丰度与外周血（Foxp3+）Treg细胞存在关联。对于Anaerostipes和Desulfovibrio,高低丰度组之间未观察到以上免疫指标存在统计学差异。按照高低水平,分别将外周血中DC1细胞、Th1细胞、IFN-γ、IL-12和肿瘤组织中DC细胞、CD8+T细胞密度分为两组,结果显示高水平组与低水平组患者的肠道菌群β多样性显著不同,提示不同免疫状态的肠道菌群在菌群结构特征上存在显著差异。3.温下方可通过提高某些与PD-1疗效相关的菌群丰度,激活系统、肿瘤微环境免疫,提高PD-1单抗疗效。（1）通过FMT可以在抗生素处理的小鼠上建立稳定HFA的肠道菌群生态对粪菌移植后的小鼠肠道菌群进行动态检测发现:粪菌移植后第15天基本达到稳定HFA。达到稳定状态的肠道菌群的α多样性与FMT前的人肠道菌群比较没有统计学差异。粪菌移植前后肠道菌群的物种丰度无统计学差异,但一些物种会在FMT前或FMT后富集。我们所关注的Desulfovibrio,Bifidobacterium,Anaerostipes,Alistipes,Faecalibacterium和Fusobacterium丰度在FMT前后并没有表现出丰度差异。以上结果提示:通过FMT可以建立稳定HFA肠道菌群生态,模拟临床上PD-1单抗无效患者的肠道微生态环境。（2）温下方对接受PD-1单抗治疗的HFA荷瘤小鼠的抗肿瘤效果影响从小鼠活体成像结果、肿瘤体积、肿瘤重量来看,N-FMT+PD-1单抗组HFA小鼠在种瘤后肿瘤生长速度明显快于R-FMT+PD-1单抗组,R-FMT+PD-1单抗组对PD-1单抗反应较好,提示肠道菌群影响PD-1单抗治疗效果。但当N-FMT+PD-1单抗组采用梯度温下方干预后,肿瘤生长速度显著减慢。小鼠肿瘤组织HE染色发现:N-FMT+PD-1单抗组肿瘤细胞密集,坏死少见;梯度温下方药物干预组存在肿瘤组织坏死,细胞碎片增多,且R-FMT+PD-1单抗组肿瘤组织坏死最为严重。结果提示:N-FMT+PD-1单抗组抗肿瘤效果最差,但N-FMT+PD-1单抗组经温下方干预后抗肿瘤效果得以明显改善。（3）温下方对接受PD-1单抗治疗的HFA荷瘤小鼠的肿瘤免疫微环境、肠道黏膜局部免疫状态、血清中免疫细胞因子水平的影响对瘤体组织、肠道黏膜免疫组化染色后发现:N-FMT+PD-1单抗组DC浸润、CD8+T细胞水平最低,R-FMT+PD-1单抗组水平最高;N-FMT+PD-1单抗组经梯度温下方干预后,DC浸润、CD8+T细胞水平显著增高。Fox P3+染色发现,N-FMT+PD-1单抗组Treg水平最高,R-FMT+PD-1单抗组水平最低,N-FMT+PD-1单抗组经梯度温下方干预后Treg水平显著下降。对血清中免疫细胞因子水平检测发现:小鼠血清中INF-α、INF-β、INF-γ、IL-12细胞因子水平在N-FMT-PD-1单抗组最低,R-FMT-PD-1单抗组最高。N-FMT-PD-1单抗组经梯度温下方干预后INF-α、INF-β、INF-γ、IL-12水平显著增高。以上结果提示:温下方可以显著活化肿瘤免疫微环境、肠道黏膜局部抗肿瘤免疫,改善N-FMT+PD-1单抗组存在的免疫失衡;温下方可能通过活化DC细胞,促进DC细胞成熟,增加DC细胞I/Ⅱ型IFN、IL-12等细胞因子分泌水平,诱导CD8+T细胞提升IFN-γ的产量,从而提高PD-1单抗的抗肿瘤疗效。（4）温下方对HFA荷瘤小鼠肠道菌群的影响温下方可以显著提高肠道菌群中与PD-1疗效相关的“Bifidobacterium、Alistipes、Desulfovibrio、Faecalibacterium和Anaerostipes”丰度,增加肠道菌群多样性（Shannon指数）。提示:温下方可能通过调整肠道菌群的方式提高了PD-1单抗的治疗效果。结论:在NSCLC中,肠道菌群与PD-1单抗的疗效密切相关,有效组和无效组患者有不同的肠道菌群特征。总体上来讲,两组之间的菌群差异主要表现为稀有低丰度菌群的差异。某些菌群特征性地在有效组或无效组富集,且具有预测PD-1单抗疗效的价值,是一种具有潜在的生物标志物。在有效组富集的特征菌群可能通过活化DC1细胞激活CD8+T淋巴细胞、提高Th1数量比例来增加免疫细胞因子INF-γ的分泌,最终起到提高抗肿瘤免疫的效果。温下方可通过提升Bifidobacterium、Alistipes和Faecalibacterium特征菌群的丰度,活化DC细胞,促进DC细胞成熟,增加DC细胞I/Ⅱ型干扰素、IL-12的分泌。活化的DC细胞诱导CD8+T细胞活化,提高系统免疫和肿瘤免疫微环境抗肿瘤免疫活性,最终起到增效PD-1单抗疗效的作用。本研究将祖国传统医学应用于解决临床最棘手的免疫治疗耐药问题,通过利用微生物组学,有望带来全新的精准疗法,为临床工作者提供利用中医药调控肠道菌群来提高免疫疗效的新方向。