第一章RIP,c-FLIP在肝癌中的表达及意义目的：受体相互作用蛋白(receptor-interacting protein,RIP)是在肿瘤坏死因子(TNF)信号途径中发挥重要作用的效应器,在细胞增殖和凋亡过程中起重要作用。细胞型Fas相关死亡区域蛋白样白介素-1转换酶抑制蛋白(celluar FLICE-like inhibitory protein,c-FLIP)是一种重要的细胞凋亡抑制蛋白。本章旨在探究RIP,c-FLIP在肝癌中的表达及意义。方法：选取2005年1月至2009年12月期间在中南大学湘雅三医院普外科和湘雅医院普外科确诊的80例肝癌患者的肝癌组织进行研究,再取肝内胆管结石患者正常肝组织40例作为对照。应用免疫组化法对实验组及对照组中c-FLIP和RIP蛋白的表达情况进行检测。分析RIP和c-FLIP在肝癌组织中的表达与肿瘤的病理学分级和患者临床分期及复发远处转移之间的相关性。结果：RIP、c-FLIP的表达定位于细胞胞浆中,肝癌实验组阳性细胞表达率分别为78.8%和85.0%,而在对照组正常肝组织中阳性细胞表达率分别为12.5%和17.5%。RIP和c-FLIP阳性表达与肝癌远处转移及术后复发相关,而与肿瘤大小、临床分期等其他因素无关。RIP和c-FLIP在肝癌组织中表达呈显著正相关。结论：1.c-FLIP、RIP在肝癌组织中高表达而在肝正常组织中低表达。2. c-FLIP和RIP在肝癌组织中的表达水平与肝癌患者的临床病理参数密切相关。3.c-FLIP和RIP可能共同参与了肝癌的细胞凋亡、发生、发展。第二章RIP、c-FLIP基因表达在TRAIL诱导肝癌细胞凋亡中的作用目的：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)通过死亡受体途径诱导的细胞凋亡是体内天然抗肿瘤的重要机制,但是TRAIL抵抗是肝癌预后不良的重要原因。化疗药物能逆转肝癌细胞HepG2及Hep3B对TRAIL诱导凋亡的抵抗,其机理在于下调传导TRAIL信号的死亡诱导信号复合物(death-inducing signaling complex, DISC)中RIP和c-FLIP的表达。本章构建RIP和c-FLIP基因沉默的肝癌细胞模型,旨在研究RIP和c-FLIP的表达变化对TRAIL诱导凋亡的影响。方法：通过siRNA (small interfering RNA)技术建立HepG2及Hep3B细胞系的RIP和／或c-FLIP基因沉默的亚克隆细胞模型,并进行下列研究：进行TRAIL诱导凋亡的DISC分析,明确细胞凋亡信号的传导是否受阻于DISC水平；应用c-FLIP、RIP的siRNA,进一步检测c-FLIP、RIP在抑制半胱-天冬氨酸蛋白酶8(cysteine containing aspirate specific protease8,Caspase-8)活性。结果：用TRAIL治疗浓度100ng/ml按不同时间处理HepG2及Hep3B细胞系,Caspase-8/9/3的活化程度减弱,并且没有DFF45的裂解。化疗药物丝裂霉素、阿霉素作用后,对DISC内DR4、DR5的表达无明显影响,TRAIL单独应用组c-FLIP及RIP的表达明显较强,FADD的表达水平较低,经化疗药物作用后,明显下调了c-FLIP及RIP的表达及上调了FADD的表达。干扰c-FLIP和RIP的基因表达后,随着TRAIL作用浓度的增加,其杀伤细胞的能力也逐渐增加,并且,这种杀伤细胞的效应是通过诱发细胞凋亡来实现的,细胞周期分析显示,与对照组相比,siRNA组的subG1百分率明显增高,细胞明显出现G1期生长阻滞。结论：1. Caspase-8的活化受抑是肝癌细胞系HepG2及Hep3B对TRAIL抵抗的直接原因。2. c-FLIP及RIP在DISC内的高表达是肝癌细胞系HepG2及Hep3B对TRAIL抵抗的主要原因。3. c-FLIP及RIP的表达下调能够解除Caspase-8的受抑状态,促进凋亡信号的传导。第三章调节RIP、c-FLIP对TRAIL诱导肝癌细胞凋亡的影响目的：癌症细胞的生存依赖于糖代谢以及此代谢过程中产生的ATP供能,抑制糖代谢的过程是抗癌症治疗的一种可能方案。2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)是一种合成的糖原类似物,是由己糖激酶磷酸化后转移至细胞,但它不能被完全代谢。2-DG的磷酸化在细胞中积聚,使得正常糖代谢的磷酸化过程受到干扰和抑制,并导致ATP被大量消耗。2-DG也能够导致蛋白的糖基化受到抑制,导致内质网(endoplasmic reticulum,ER)张力增高,并增加激活蛋白质的合成反应。研究表明,2-DG具有调节RIP、c-FLIP的作用。本章旨在从2-DG角度,探究2-DG与RIP、c-FLIP的关系,进而阐明调节RIP、c-FLIP对TRAIL诱导肝癌细胞凋亡的影响。方法：通过细胞生存能力分析、线粒体膜电位变化和PI染色测定细胞凋亡来研究2-DG对肝癌细胞凋亡的影响及其机制。通过定量RT-PCR、Western blot分析和siRNA技术研究2-DG对RIP、c-FLIP的调节及调节RIP、c-FLIP对肝癌细胞凋亡的影响。结果：2-DG单独时并不诱导明显细胞凋亡,但是,它可以抑制细胞的分化；2-DG和TRAIL结合增强了TRAIL诱导的抗分化和细胞凋亡。本研究用JC-1荧光探针标记线粒体膜的变化,出现损坏的线粒体膜时,JC-1的染色显示绿色荧光,正常细胞显示红色荧光,肝癌细胞与2-DG和TRAIL结合后出现明显线粒体膜的损害,显示绿色荧光。caspase抑制剂z-VAD-fink能抑制HepG2细胞系和Hep3B细胞系出现TRAIL诱导的细胞凋亡。更为重要是在有2-DG和缺乏2-DG的情况下,在caspase抑制剂作用下TRAIL诱导的细胞凋亡情况有明显的统计学差异(P<0.05)。用定量RT-PCR研究显示在2-DG作用3小时后,RIP、c-FLIP的表达量持续降低。siRNA时,RIP、C-FLIP的下调与2-DG有密切的相关性,通过2-DG下调RIP、-FLIP的表达是增加TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡敏感性的关键。结论：1.RIP、c-FLIP可通过2-DG被下调,进而增加TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡。2.2-DG依赖caspase增加TRAIL诱导的细胞凋亡。