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随着生命科学研究的不断深入,对各种生命现象发生的机制,特别是对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用的研究变得尤为重要。基于绿色荧光蛋白的荧光共振能量转移技术(GFP-FRET)是探测活细胞中蛋白-蛋白相互作用的重要方法。一对合适的FRET供体/受体荧光对要求供体的荧光量子产率(Q_D)要尽可能大;供体和受体的光谱重叠积分J(入)较大;供体和受体之间光谱干扰(cross-talk)要尽量小;用于FRET检测的荧光探针在特定的细胞中要有较高的信噪比(S/B)以及能量供体/受体对要有适度的光漂白性质。CFP、YFP为目前蛋白-蛋白相互作用研究中应用最广泛的FRET对。但CFP-YFP对存在有一定的不足(如荧光量子产率低、传能效率低、对环境敏感、CFP不适合用激光作为激发光等)。MiCy、Citrine、mKO为最近报道的三种新型荧光蛋白。MiCy的荧光量子产率高达0.9,而且由于它的最大激发波长位于472nm,更加适合使用激光(457nm)进行激发。Citrine是第三代的YFP突变体,其荧光量子产率也有了一定的提高,而且具有很好的抗酸性和抗光漂白性。mKO突变于从珊瑚中提取的一种新型荧光蛋白KO,其具有较高的荧光量子产率和稳定性,较好的抗酸性和抗光漂白性。从荧光光谱来看,MiCy的发射光谱与Citrine的激发光谱、Citrine的发射光谱与mKO的激发光谱都有了更大的重叠。基于以上考虑,本文就MiCy/Citrine:Citrine/mKO两对荧光蛋白组成新的FRET对的可行性进行讨论,并初步探索了三种荧光蛋白组成多色FRET组的可行性。 首先,构建了含有六个组氨酸标签的三种荧光蛋白MiCy、Citrine和mKO,而后在大肠杆菌中表达了MiCy、mKO和Citrine三种蛋白,并用金属鳌合亲和层析进一步纯化,纯化产物使用特异性酶(肠激酶)去除His-tag。 然后对三种荧光蛋白进行了光谱学研究。求得了MiCy/Citrine和Citrine/mKo传能对的F(?)rster距离分别为5.81nm和5.65nm(而CFP/YFP传能对的F(?)rster距离只有4.9nm),从而说明了它们作为一对FRET对的可能性。并且进一步在荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜上测量了二者作为FRET对的合理性。实验结果表明:无论在荧光分光光度计还是在激光共聚焦显微镜上,都能明显的观测到能量转移现象。 最后,初步探讨了MiCy、Citrine、mKO组成的三色FRET组的可行性,并且在荧光分光光度计上进行了验证,可以观察到明显的能量转移现象。