论文部分内容阅读
Serpin(serine protease inhibitor)是一种多肽类丝氨酸蛋白酶抑制剂的总称,由350至500个氨基酸组成。2006年研究发现长双歧杆菌的菌体表面存在着Serpin,能够保护菌体抵抗外源蛋白酶的消化,为其粘附定植肠道提供前提条件。目前,Serpin蛋白对双歧杆菌物质代谢,繁殖扩增等方面的影响不甚清楚。在前期研究中,本实验室筛选到一株产Serpin蛋白的婴儿双歧杆菌,证实原核克隆表达的Serpin蛋白能有效抑制糜蛋白酶和胰弹性蛋白酶的活性,并促进双歧杆菌体外粘附细胞;本研究拟通过导入置换型打靶载体,构建基因缺失株的方法,进一步研究表面蛋白Serpin的功能。然而由于双歧杆菌的细胞壁过厚,外源基因导入困难,导致转化效率极其低下,因此本研究一方面要获得高活力的双歧杆菌原生质体,另一方面通过原生质体转化及同源重组获得serpin基因缺失株。
双歧杆菌原生质体制备的文献报道甚少,本文分别评价了多种因素(生长状态、酶解浓度、时长、温度以及不同渗透压稳定剂等)对长双歧杆菌原生质体制备的影响,获得了长双歧杆菌WBL001原生质体制备及再生的优化条件:菌体处于对数中期(OD600为2.0),以棉子糖溶液(SMM)为原生质体稳定液,5mg/L变溶菌素,3.7℃孵育30min,原生质体生成率和再生率分别达到81％和48%,目前报道中革兰氏阳性菌的原生质体再生率在30%左右。
在此基础上,通过原生质体的PEG介导转化,将构建的双歧杆菌serpin的置换型打靶载体UPD导入双歧杆菌,成功构建了serpin缺失株,并对缺失株的体外细胞粘附能力进行了分析研究,发现serpin缺失对双歧杆菌的黏附没有明显影响。
综上所述,本文通过构建原生质体转化体系,成功实现了serpin的敲除,为研究益生菌的功能蛋白提供了方法学参考。