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目的使用本实验室研制的改良型固体Hartleys培养基培养丝状支原体山羊亚种PG3株，获得菌体经冻融裂解制备抗原；通过动物免疫、间接ELISA方法建立、细胞融合、阳性克隆筛选、亚克隆，获得能分泌抗体的单克隆细胞株；制备、纯化腹水，进行效价和特异性鉴定，以获得效价高、特异性强的单克隆细胞株；为研究丝状支原体山羊亚种表面抗原结构、筛选保护性抗原奠定基础；同时以单克隆抗体为包被原，山羊抗PG3纯化多抗为夹心抗体，建立双抗夹心ELISA方法，为山羊传染性胸膜肺炎的诊断、流行病学调查建立一种简单、快速、特异性强、灵敏度高的方法。方法结合国内外文献报道依据本实验室的具体情况，使用本实验室研制成功的“改良型Hartleys培养基”进行丝状支原体山羊亚种PG3的复苏和扩大培养；从固体培养基上洗脱菌体，经低速离心去除沉淀，上清液高速离心获得菌体，使用PBS洗涤三次，-20℃冻融裂解后低速离心弃除沉淀，获得上清即为膜蛋白，测定蛋白含量。将所得膜蛋白以一定量与弗氏佐剂混合充分乳化，免疫BALB／c小鼠，330μg／只，共免疫四次；采血测定血清抗体效价并建立间接ELISA方法，待血清效价大于1：5000时进行细胞融合。取血清效价高的BALB／c小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞在50％PEG1500的作用下进行细胞融合；使用已建立的间接ELISA进行筛选，阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆；得到的单克隆细胞株进行扩大冻存及腹水制备。腹水进行效价测定、特异性检测；使用试剂盒测定其抗体亚型，进行抗体纯化、纯度检测。以纯化的单抗包被酶标板、纯化山羊抗PG3多抗作为夹心抗体，建立双抗夹心ELISA方法并进行特异性、灵敏度检测及初步应用。结果丝状支原体山羊亚种PG3在改良型Hartleys培养基得到成功复苏和扩大培养，膜蛋白质含量为1.65mg／mL；四次免疫后小鼠抗体效价达到1：6400以上。以50％PEG1500进行细胞融合，融合孔为364孔，融合率达到75.8％；经间接ELISA筛选，共得31个阳性孔，阳性率为8.5％，两次亚克隆后得到四株单克隆细胞株：1C10、1E2、2E8、2F12，经腹水制备、效价检测、特异性检测最终得到1E2株，其抗体亚型为IgG3、κ型，SDS-PAGE检测纯度较高。建立的双抗夹心ELISA单抗包被浓度为1：200稀释（20μg／mL），山羊抗PG3多抗工作浓度为1：400稀释，其检测下限为2μg／mL，检测猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、马血清等均为阴性。使用双抗夹心ELISA和间接ELISA对12份有临床症状山羊的鼻腔拭子、血清进行检测，前者阳性率为58.3％，后者阳性率为66.7％；对于其中症状典型的5只，双抗夹心ELISA检测全为阳性，阳性率100％，间接ELISA阳性为3只，阳性率60％。仅偶见干咳的7只，双抗夹心ELISA检测出2只阳性，阳性率28.6％，间接ELISA法检测出5只阳性，阳性率71.4％。结论使用改良型Hartleys培养基及冻融法成功地获得了PG3膜蛋白，通过动物免疫、细胞融合、间接ELISA筛选、亚克隆获得四株能分泌抗体的单克隆细胞株，以其中一株效价较高、特异性强的单克隆抗体为包被原，建立了双抗夹心ELISA检测方法。双抗夹心ELISA与间接ELISA相比适合于对早期发病山羊的检测、诊断，而间接ELISA更适合用于流行病学调查。