第一部分、大鼠DMRT1基因慢病毒过表达载体的构建　　目的：探索构建大鼠骨髓间充质干细胞中DMRT1过表达慢病毒载体的技术方法。　　方法：提取SD大鼠睾丸组织总RNA通过RT-PCR获取cDNA文库；据Genebank获得大鼠DMRT1编码区全长序列，按照慢病毒载体酶切位点，设计DMRT1上下游引物，通过聚合酶链反应（PCR）获得DMRT1基因片段；与双酶切线性化的慢病毒载体质粒（Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP）连接，完成过表达DMRT1的慢病毒载体质粒的构建；然后经过氨苄青霉素抗性筛选、阳性转化子PCR鉴定，进行阳性克隆测序鉴定。通过重组病毒质粒与包装质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装并获取慢病毒液，采用定量PCR测定慢病毒滴度。　　结果：PCR以及测序结果显示成功构建含有大鼠DMRT1基因的重组慢病毒表达质粒；重组质粒转染293T细胞可观察到明显的绿色荧光，经Western blot检测，Flag标签蛋白阳性，说明重组质粒转染正常、重组质粒荧光标记基因GFP表达正常。包装并检测慢病毒浓缩滴度为2.0×108 TU/mL。　　结论：成功构建DMRT1基因慢病毒过表达载体，获得DMRT1基因过表达慢病毒，为后续实验提供病毒支持。　　第二部分、DMRT1基因过表达慢病毒转染雄性大鼠的骨髓间充质干细胞　　目的：建立稳定过表达DMRT1基因的SD雄性大鼠骨髓间充质干细胞群。　　方法：通过全骨髓培养法得到SD雄性大鼠骨髓间充质干细胞,并使用成骨和成脂诱导方法对其进行分化鉴定。将获得的DMRT1基因过表达慢病毒转染第三代生长状态良好的骨髓间充质干细胞。使用Real-PCR和Western Blot技术检测骨髓间充质干细胞中DMRT1 mRNA和蛋白水平的过表达情况。　　结果：慢病毒有效感染SD雄性大鼠骨髓间充质干细胞，可观察到明显的绿色荧光。与阴性病毒对照组和正常大鼠骨髓间充质干细胞组相比，慢病毒过表达组在mRNA水平上表达明显增高（P＜0.01），采用2-ΔΔCT法分析CT值，过表达慢病毒组的DMRT1基因的mRNA的相对表达量为正常rBMSCs组的512倍。过表达慢病毒组的DMRT1蛋白相对表达量为正常rBMSCs组的6倍。　　结论：SD雄性大鼠骨髓间充质干细胞中成功稳定过表达DMRT1基因。为进一步研究DMRT1基因在骨髓间充质干细胞中的作用机制，对精子发生以及骨髓间充质干细胞向雄性生殖细胞诱导分化具有重要意义。　　第三部分、过表达DMRT1对大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化作用　　目的：探讨转录因子DMRT1对雄性大鼠骨髓间充质干细胞多能性因子以及减数分裂相关因子的调节作用。　　方法：将实验分为三组，第一组：只添加培养基的未处理组；第二组：在培养基内添加RA全反式维甲酸进行体外诱导的正常组；第三组：阴性对照病毒组，先用阴性对照病毒转染细胞，然后在培养基内添加RA全反式维甲酸进行体外诱导；第四组：DMRT1过表达慢病毒组，先用慢病毒转染细胞，然后在培养基内添加RA全反式维甲酸进行体外诱导。每组细胞分别诱导培养1d、7d、14d、21d，收集细胞。通过Real-PCR技术检测内源多潜能因子、减数分裂相关因子的表达情况，Western Blot技术用于检测DMRT1过表达对STRA8蛋白表达的影响。　　结果：未处理组rBMSCs只表达内参β-actin和低水平的DMRT1、OCT4基因，并不表达STRA8、SYCP3、DDX4、SOX2和NANOG基因。RA诱导过表达DMRT1的BMSCs第7天和第14天过表达慢病毒组STRA8的mRNA相对表达量低于正常组和阴性对照组，第14天STRA8的蛋白相对表达量也低于正常组和阴性对照组。（P<0.05）。诱导第7天和第14天过表达组OCT4 mRNA表达量低于正常组和阴性对照组，但无统计学差异。三组细胞在诱导第21天均出现了DDX4 mRNA的表达，均未检测出SYCP3、SOX2和NANOG基因的表达。　　结论：在BMSCs中DMRT1具有抑制减数分裂相关因子STRA8的表达的功能，但是并未发现DMRT1对多能性相关因子的调节作用。