目的通过百日咳杆菌及其他多种病原检测了解湖南地区痉挛性咳嗽儿童感染病原谱并总结其临床特点,指导临床治疗,为本地区儿童呼吸道感染的防治及进一步的研究奠定基础。方法1.建立检测百日咳杆菌(Bordetella pertussis,BP)的实时荧光定量PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性等进行评估。2.收集2015年1月-2015年12月湖南地区因痉挛性咳嗽就诊儿童的鼻咽拭子及鼻咽抽吸物(Nasopharyngeaaspirates samples,NPAs)标本。3.采用实时荧光定量PCR法,对鼻咽拭子标本进行百日咳杆菌(BP)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、冠状病毒(HCOV-229E、HCOV-OC43)、博卡病毒(HBOV)、鼻病毒(HRV)、流感病毒(IFVA-B)、副流感病毒(PIV1-3)的检测。采用细菌培养法对NPAs标本进行细菌检测。4.对湖南地区痉挛咳嗽儿童的感染病原谱及临床特点进行分析。结果1.已建立的实时荧光定量PCR法在BP检测浓度为2×102-109copies/ml范围内有良好的线性,线性相关系数为0.9997。2.实时荧光定量pcr法的最低检测限为200copies/ml。3.建立的实时荧光定量pcr法检测其它常见病原体(包括肺炎支原体,肺炎衣原体,腺病毒,流感病毒,鼻病毒,呼吸道合胞病毒,人类冠状病毒229e,人类冠状病毒oc43,人类冠状病毒hku1,人类冠状病毒nl63,人类博卡病毒等)均无扩增曲线,特异性好。4.采用建立的实时荧光定量pcr法分别对低浓度与高浓度两个不同浓度的标准品各重复检测8次,汇总获得ct值,分别计算其平均数、标准差和8次检测结果的变异系数。所有样本检测均为阳性,并且变异系数均小于5%,表明该方法的稳定性和重复性好。5.实时荧光定量pcr法检测浓度梯度为1×108cfu/ml、1×107copies/ml、1×106cfu/ml、1×105cfu/ml、1×104cfu/ml、1×103cfu/ml的6个百日咳标准株样本,均能看到明显扩增曲线,提示该检测方法灵敏度及准确度高。6.用已建立的实时荧光定量pcr法检测2份临床高度疑诊百日咳的鼻咽拭子标本,均能看到扩增曲线,扩增片段送测序,测得的序列与美国生物技术信息中心(ncbi)genbank中已知序列进行blast比较,结果同源性为100%,无碱基突变,证实所检样本为bp,该方法检测准确度高。7.280例标本中明确病原感染的有219例,病原总检出率78.2%(219/280),bp检出率居首位47.9%(134/280),其次为rsv10.4%(29/280)、mp8.6%(24/280)、hpiv38.2%(23/280)、adv7.1%(20/280);其中单一病原感染的141例,混合感染的78例,所占比例分别为64.4%、35.6%,提示湖南地区儿童痉挛性咳嗽以单一病原感染引起为主;混合感染的78份标本中,混合bp感染的59份,检出率75.6%,其他病原混合感染的19份,检出率24.4%,提示引起痉挛性咳嗽的混合感染病原中,以bp混合感染为主。bp混合感染的主要病原是adv,检出率4.98%,居首位,其次是bp+rsv2.71%,bp+flua2.26%,bp+mp、bp+流感嗜血杆菌、bp+rhv各占1.81%。8.回顾性分析75例bp单一感染患儿的临床特征,结果发现bp检出阳性的患儿在各个年龄阶段均有分布,但以2~4月的小婴儿居多,而年龄≤12月的婴幼儿普遍存在疫苗适龄未接种情况,以3~6月年龄段疫苗未接种率最高,达54.8%;百日咳在四季均有发病,以秋季发病率最高40.0%(30/75),其次为夏季26.7%(20/75)、春季22.7%(17/75),冬季发病率最低10.7%(8/75);bp感染的患儿临床表现多样,可见痉挛性咳嗽伴鸡鸣样吼声、颜面憋红、发绀、呕吐等,76%的患儿出现咳时颜面憋红,最常见;69.3%的患儿夜间咳嗽多;伴随症状包括发热、喘息、流涕等,无明显特异性。血常规示白细胞增多,以淋巴细胞增多为主,73.3%的患者白细胞计数≥10×109/l,且淋巴细胞百分比>60%;70.7%的患儿肺部影像学呈现无异常和支气管炎改变;12%的患儿在症状出现前21天内接触过咳嗽患者,接触成员均为接触密切的家庭成员;大环内酯类药用率达82.7%,81.3%的患儿出院时仍有痉咳。9.将141例单纯病原感染样本中75例bp检出阳性的纳入百日咳组,其他单一病原检出阳性的纳入非百日咳组,两组进行临床特征比较,两组在性别分布上无显著差异;两组在年龄分布上均以2~4月龄患儿为多,≤12月年龄段百日咳组病原检出率明显高于非百日咳组,差异有统计学意义(p<0.05);两组在总病程、疫苗未接种率、大环内酯类药物使用率上比较无统计学差异;两组在咳时颜面憋红、发绀、咳后鸡鸣样吼声、夜间咳嗽、发热、肺部听诊啰音及出院仍痉咳等特征上比较差异有统计学意义(p<0.05),百日咳组临床痉挛性咳嗽时多伴颜面憋红、发绀、咳后鸡鸣样吼声,以夜间咳多,很少伴有发热及肺部啰音,出院时仍多有痉挛性咳嗽;百日咳组白细胞计数在15×109/l以上的占37.3%,淋巴细胞百分比集中在60~80%占69.3%,与非百日咳组比较差异有统计学意义(p<0.05);百日咳组肺部影像学结果以支气管炎改变居多,而非百日咳肺部影像学结果则以肺炎改变居多,两组比较差异有统计学意义(p<0.05)。结论1.成功建立百日咳杆菌的实时荧光定量pcr检测方法,为临床诊断百日咳杆菌感染提供了新的快速检测方法。2.bp、rsv、mp、hpiv3及adv是引起湖南地区儿童痉挛性咳嗽的常见病原体,其中bp占主要地位;3.bp感染的患儿在年龄、季节、临床表现等方面存在一定的特征性,且通常存在百日咳疫苗适龄未接种情况;4.相对于其他病原所致的痉挛性咳嗽,百日咳杆菌感染的患儿临床上年龄多≤12月,痉挛性咳嗽时多伴颜面憋红、发绀或咳后鸡鸣样吼声,以夜间咳多,很少伴有发热症状及肺部啰音,出院时仍多有痉挛性咳嗽。血象检查多有白细胞计数增高,且以淋巴细胞增高为主,白细胞计数多>15×109/L,淋巴细胞百分比多集中在60~80%。肺部影像学结果以支气管炎改变居多,而非百日咳组白细胞计数多≤10×109/L,肺部影像学结果则以肺炎改变居多。这些特征有助于临床早期诊断百日咳,并指导临床抗生素的合理使用。