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体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)在创制基因修饰动物方面已展现出巨大的应用价值,是一种在家畜抗病育种材料创制、疾病模型构建和基础医学研究等方面具有广阔应用前景的技术。以转基因克隆动物的体细胞为核供体进行SCNT,开展再克隆以获得更多转基因动物已被证明是可行的。然而目前关于转基因猪再克隆的研究有限且再克隆效率也不理想。研究表明,利用组蛋白去乙酰化抑制剂Scriptaid处理非转基因供体细胞或SCNT重构胚胎可改善克隆胚胎发育。本实验室前期创建了抗猪传染性胃肠炎的APN基因编辑克隆猪。为建立并优化APN基因编辑克隆猪体细胞制备和再克隆胚胎生产方案,为今后实现APN基因编辑猪扩群提供技术参考,本研究首先从APN基因编辑猪耳部皮肤组织内分离建立了皮肤成纤维细胞系证明了其再克隆的可能性,接着利用Scriptaid处理体细胞或再克隆胚胎,探明了Scriptaid对体细胞体外生长和再克隆胚胎早期发育的影响,具体结果如下:(1)APN猪皮肤成纤维细胞建系及再克隆尝试。通过体外培养成功获得APN猪的皮肤成纤维细胞系,该细胞具有一般成纤维细胞的生物学特征,可进行SCNT操作。APN猪体细胞作供体细胞再克隆SCNT胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数与非转基因供体细胞组相比均无显著差异(78.8%、3.56、28 Vs.76.24%、4.11%、34;P>0.05)。(2)Scriptaid处理对APN猪皮肤成纤维细胞及再克隆的影响。发现使用500 nM Scriptaid处理24 h对细胞的生长有抑制作用但对细胞存活、形态影响不明显。处理组细胞再克隆的SCNT胚胎卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数与未处理组相比也无明显差异(P>0.05)。(3)Scriptaid处理APN猪再克隆SCNT胚胎对其体外发育的影响。使用500 nM Scriptaid处理APN再克隆SCNT胚胎14-16 h,发现Scriptaid处理组卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数均显著优于未处理组(80.55%、5.8%、32 Vs.50.93%、3.1%、30,P<0.05)。综上所述,本研究成功建立了 APN基因编辑克隆猪的皮肤成纤维细胞系,并基于Scriptaid干预建立了可促进再克隆胚胎发育的处理方案,即使用细胞代次为3-6代的APN猪皮肤成纤维细胞生产再克隆胚胎,获得的重构胚用Scriptaid处理14-16 h,可提高其发育效率。总之,本研究证实了 APN猪体细胞建系及其再克隆的可行性,为今后开展抗猪传染性胃肠炎的APN猪再克隆工作奠定了坚实的基础。