农杆菌介导丹东蒲公英遗传转化研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:sanhaijin123
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蒲公英体内含有萜类,酚类和多糖等活性成分。此外,已发现酚类中的绿原酸具有抗菌,抗氧化等作用。目前,植物次生代谢物生物合成的代谢调控是一种可能的手段,并可以改善高价值的次生代谢产物产量。已知羟基肉桂酰-CoA:奎尼羟基肉桂酰基转移酶(HQT)是植物中绿原酸合成途径中的一个关键酶。本试验利用植物无菌苗叶片为外植体,建立了丹东蒲公英(Taraxacum antungense Kitag.)再生体系,并利用农杆菌介导的方法,建立了遗传转化体系,并将HQT基因导入到丹东蒲公英植物基因组内。本试验结果如下:1.本试验以丹东蒲公英无菌苗作为叶片外植体来源,建立了丹东蒲公英再生体系。直接诱导叶片外植体不定芽再生的最佳培养基是MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,最大的再生频率为95.2±2.58%。然后通过对不定芽进行生根培养条件的筛选,得到生根的最佳培养基是1/2 MS+0.1 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,最大生根率是99.0±0.58%。2.本试验确立了农杆菌介导的丹东蒲公英遗传转化方案:叶片外植体预培养时间48 h,根癌农杆菌GV3101菌液OD600浓度0.6左右,外植体感染持续时间10 min,AS浓度50 mg/L,共培养时间48 h这些参数用于本试验转化。最初侵染后的外植体在含有30 mg/L卡那霉素和500 mg/L头孢霉素的不定芽诱导培养基上培养。在抗性芽诱导后期头孢霉素的浓度可选择250 mg/L。最终,卡那霉素选择抗性芽生根的浓度是15 mg/L。3.本试验首先用PCR对抗性植株进行分析,表明HQT基因成功导入到丹东蒲公英的基因组中,转化效率是5.7%。然后,通过q RT-PCR和HPLC的方法对转基因植株和野生型植株进行分析,发现3株转基因植株叶片中的HQT基因相对表达量和绿原酸含量都比野生型植株要高。最后,本文得出3株转基因植株中绿原酸含量分别是1.12,1.34和0.94 mg/g,野生型植株中绿原酸含量是0.74 mg/g。
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