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研究背景泡型棘球蚴病（Alveolar echinococcosis,AE）是多房棘球绦虫幼虫或多房棘球蚴引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫疾病。多房棘球蚴好寄居于人或啮齿动物等中间宿主的肝脏（约占97%以上）,呈类肿瘤样侵袭性增殖对寄居肝脏造成持续损害,以进行性肝纤维化为主,或转变为肝硬化,因此又常被称为“虫癌”。阿苯达唑（Albendazole,ABZ）是当前AE临床治疗的首选药物,能限制多房棘球蚴的快速增殖,但水溶性差、口服利用度低及长期服用后产生的毒副作用明显,因此,寻找安全有效的泡型棘球蚴病及其肝纤维化的治疗药物十分重要与迫切。去甲二氢愈创木酸（Nordihydroguaiaretic acid,NDGA）具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗肺纤维化和抗血管生成等生物学功能。本实验前期基于分子对接虚拟筛选技术和抗棘球蚴实验初步发现,NDGA对囊型棘球蚴病具有明显缓解作用,但对类癌样的泡型棘球蚴病及其引起的肝纤维化的治疗作用和机制尚不清楚。因此,本文将研究NDGA对多房棘球蚴生长增殖的影响及作用机制,NDGA通过调控肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSC）对多房棘球蚴感染和非棘球蚴感染引起的肝纤维化的干预作用及机制,进而为泡型棘球蚴病和肝纤维化的临床用药提供新的参考。研究方法1.分离实验室感染的沙鼠多房棘球蚴,体外经NDGA和ABZ-SO（ABZ抑虫的有效成分,阳性对照）处理7 d,采用化学发光法和电镜技术等检测多房棘球蚴原头节（Protoscoleces,PSC）活力及培养上清中Em ALP含量、生发层细胞增殖率和微囊活力。NDGA（50μmol/L）及与Notch信号激动剂JAG1（0.5μg/m L）或拮抗剂DAPT（40μmol/L）联合体外处理PSC 7 d,采用电镜技术、免疫荧光和荧光定量PCR（RT-q PCR）技术等检测PSC的存活率和超微结构变化,及Notch1、Jagged1、Akt蛋白和m RNA表达量。随后,通过肝脏原位种植感染建立肝泡型棘球蚴病小鼠模型,经NDGA（100 mg/kg·d）和ABZ（阳性对照,100 mg/kg·d）灌胃干预3个月,称量多房棘球蚴囊重量,采用免疫荧光法、蛋白印迹法（WB）和RT-q PCR等检测多房棘球蚴囊和肝脏中Notch1、Jagged1、Akt蛋白和m RNA表达量。2.NDGA（100 mg/kg·d）干预肝泡型棘球蚴病小鼠3个月,采用免疫放射法和ELISA检测血清中HA、LN、CIV、PCⅢ、α-SMA和Col1含量;采用天狼星红染色、Masson染色、WB和RT-q PCR检测肝脏中胶原纤维沉积量,α-SMA和Col1蛋白及m RNA表达量。随后,通过密度梯度离心法分离NDGA干预前后泡型棘球蚴病小鼠原代HSC并体外培养120 d,采用免疫荧光法和ELISA等检测HSC及培养上清中α-SMA和Col1含量。3.NDGA（50μmol/L）单独或与JAG1（0.5μg/m L）或DAPT（50μmol/L）联合体外处理肝星状细胞（HSC-T6和LX-2细胞）24 h,通过细胞增殖实验、迁移实验、Transwell实验和收缩实验检测细胞增殖率、迁移率、侵袭率和收缩率。随后,采用ELISA检测HSC-T6细胞培养上清中α-SMA和Col1含量,采用免疫荧光、WB和RT-q RCR检测HSC-T6细胞中α-SMA、Col1、Notch/Akt信号相关蛋白和m RNA表达量。另外,NDGA（50μmol/L）体外处理HSC-T6细胞和LX-2细胞24 h,采用流式技术检测细胞周期和其凋亡率。4.通过腹腔注射四氯化碳（Tetrachloromethane,CCL4）诱导、胆管结扎（Bile duct ligation,BDL）诱导和日本血吸虫尾蚴经皮肤感染建立大鼠或小鼠肝纤维化模型,经NDGA（100 mg/kg·d）灌胃干预8周,采用免疫放射法和ELISA检测血清中HA、LN、CIV、PCⅢ、α-SMA和Col1含量;采用天狼猩红染色、Masson染色、免疫组织化学法和RT-q PCR检测肝脏中胶原纤维沉积量,和α-SMA、Col1、Notch/Akt信号相关蛋白及m RNA表达量。5.NDGA和ABZ-SO体外分别处理HL-7702细胞和HK-2细胞48 h,采用CCK-8法和结晶紫染色检测细胞增殖率和形态变化。此外,NDGA和ABZ（100mg/kg·d）分别灌胃干预正常昆明小鼠8周,采用化学发光法和HE染色检测血清中肝肾功能指标含量和观察肝肾脏组织病理学变化。研究结果1.与未处理（The negative control,NC）组相比,NDGA（50μmol/L）组和ABZ-SO（50μmol/L）组PSC的存活率显著降低（P均＜0.05）,培养上清中Em ALP的含量显著增高（P均＜0.05）;其中,NDGA组PSC的存活率明显低于ABZ-SO组（P＜0.05）,培养上清中Em ALP的含量明显高于ABZ-SO组（P＜0.05）;同时,NDGA组PSC中PAS阳性物质、合胞体层和微绒毛等基本结构完全丧失,且胞浆内出现大量空泡和凋亡小体,而ABZ-SO组PSC中PAS物质减少、微绒毛变短和合胞体层变薄。与NC组相比,NDGA组生发层细胞的增殖率显著降低（P＜0.05）,微囊的生长增殖明显受阻及培养上清中Em ALP含量显著增高（P＜0.05）,PSC中Notch1、Jagged1、Akt蛋白和m RNA的表达量显著降低（P均＜0.05）。与NC组相比,JAG1（0.5μg/m L）组PSC的生长增殖明显加快,培养上清中Em ALP的含量无明显变化（P＞0.05）,而DAPT（40μmol/L）组PSC的存活率显著降低（P＜0.05）,培养上清中Em ALP的含量显著增高（P＜0.05）。与JAG1组相比,NDGA+JAG1组PSC的存活率显著降低（P＜0.05）,培养上清中Em ALP的含量显著增高（P＜0.05）;与NDGA组相比,NDGA+DAPT组PSC的存活率、培养上清中Em ALP的含量、及PSC中Notch1、Jagged1和Akt m RNA的表达量均无明显变化（P均＞0.05）。2.与未感染组相比,多房棘球蚴感染组小鼠血清中HA、LN、CⅣ、PCⅢ、ɑ-SMA和Col1的含量显著升高（P均＜0.05）,肝脏（近病灶肝组织）中胶原纤维的沉积量显著增多（P＜0.05）,且主要分布于多房棘球蚴周围,肝脏中ɑ-SMA、Col1、Notch1、Jagged1、Akt蛋白和m RNA的表达量显著增高（P均＜0.05）。与感染组相比,NDGA组和ABZ组中多房棘球蚴囊的重量显著降低（P均＜0.05）,NDGA组血清中HA、LN、PCⅢ和Col1的含量显著下降（P均＜0.05）,肝脏中胶原纤维沉积量显著减低（P均＜0.05）,及ɑ-SMA、Col1、Notch1、Jagged1、Akt蛋白和m RNA的表达量显著降低（P均＜0.05）。另外,与未感染组相比,多房棘球蚴感染组小鼠原代HSCɑ-SMA和Col1蛋白在体外的表达量显著增多（P均＜0.05）;与感染组相比,NDGA组小鼠原代HSCɑ-SMA和Col1蛋白在体外的表达量显著降低（P均＜0.05）。3.与NC组相比,JAG1组HSC-T6细胞和LX-2细胞的增殖率、迁移率、侵袭率和收缩率均显著升高（P均＜0.05）,HSC-T6细胞中ɑ-SMA、Col1、Notch1、Jagged1、Hes1、Akt、p-Akt蛋白和m RNA的表达量均显著增高（P均＜0.05）,而NDGA组和DAPT组HSC-T6细胞和LX-2细胞的增殖率、迁移率、侵袭率和收缩率均显著降低（P均＜0.05）,HSC-T6细胞中ɑ-SMA、Col1、Notch1、Jagged1、Hes1、Akt、p-Akt蛋白和m RNA的表达量均显著减低（P均＜0.05）;与JAG1组相比,NDGA+JAG1组HSC-T6细胞和LX-2细胞的增殖率、迁移率、侵袭率和收缩率显著下降（P均＜0.05）,HSC-T6细胞中ɑ-SMA、Col1、Notch1、Jagged1、Hes1、Akt、p-Akt蛋白和m RNA的表达量显著降低（P均＜0.05）。与NDGA组相比,NDGA+DAPT组HSC-T6细胞和LX-2细胞的迁移率、侵袭率和收缩率显著下降（P均＜0.05）,HSC-T6细胞中ɑ-SMA和Col1蛋白的表达量显著降低（P均＜0.05）,但Notch1、Jagged1、Hes1、Akt、p-Akt蛋白和m RNA的表达量无明显变化（P均＞0.05）。另外,与NC组相比,NDGA组HSC-T6细胞和LX-2细胞的凋亡率和处于G2/M期的细胞百分比均显著增高（P均＜0.05）。4.与Oil组、Sham组和对照组相比,CCL4诱导组、BDL诱导组和血吸虫感染组大鼠或小鼠血清中ɑ-SMA和Col1的含量显著升高（P均＜0.05）,肝脏中沉积的胶原纤维显著增多（P均＜0.05）,及肝脏中ɑ-SMA、Col1、Sm22、Desmin、Notch1、Notch3、Jagged1、Hes1、Akt蛋白和m RNA的表达量显著增高（P均＜0.05）。与CCL4诱导组、BDL组和血吸虫感染组相比,NDGA组血清中ɑ-SMA和Col1的含量显著降低（P均＜0.05）,肝脏中胶原纤维的沉积量显著减少（P均＜0.05）,肝脏中ɑ-SMA、Col1、Sm22、Desmin、Notch1、Jagged1、Hes1、Akt蛋白和m RNA的表达量显著降低（P均＜0.05）。5.与NC组相比,不同浓度（10、20、50、100、200和400μmol/L）的NDGA或ABZ-SO作用后,HL-7702细胞和HK-2细胞的存活率呈剂量依赖性降低;其中,当浓度大于20μmol/L时,NDGA组细胞的存活率高于等浓度的ABZ-SO组（P均＜0.05）。此外,与正常对照组小鼠相比,NDGA组小鼠血清中ALT的含量显著升高（P＜0.05）,肝脏和肾脏无明显病理学改变,而ABZ组小鼠血清中ALT和IBIL的含量均显著升高（P均＜0.05）,肝脏可见肝细胞间隙增宽、肝细胞肿胀和水样变性,肾脏无明显病理学改变。研究结论1.Notch1/Akt信号通路激活可促进多房棘球蚴侵袭性增殖,而NDGA能下调Notch1/Akt信号通路抑制多房棘球蚴生长增殖,且其杀虫效果优于ABZ-SO,为研究泡型棘球蚴病的治疗靶标和临床用药提供新的参考。2.Notch1/Akt信号通路是多房棘球蚴感染、化学性损伤（CCL4诱导）、机械性损伤（BDL诱导）和日本血吸虫感染引起的肝纤维化的共性调控机制,而NDGA可下调Notch1/Akt信号通路抑制肝星状细胞的活化与增殖进而缓解该肝纤维化,为研究寻找抗肝纤维化的药物靶标和临床用药提供新的思路。3.NDGA对人正常肝肾细胞的毒性低于ABZ-SO,对正常小鼠肝脏的亚急性毒性低于ABZ,将为NDGA治疗泡型棘球蚴病和肝纤维化的应用提供更多的参考。