论文部分内容阅读
铁是维持人和动物生理活动必需微量营养素。虽然铁是自然界最丰富的金属元素之一,但缺铁（Iron Dificency,ID）和缺铁性贫血（iron-deficiency anemia,IDA）是世界范围内常见和多发的营养性失衡病。幼龄生命如婴幼儿和新生仔猪都需要补铁以预防缺铁性贫血。肠道发育和屏障功能对机体健康起着重要作用。本研究采用体内和体外相结合的研究方法,选用猪肠细胞构建缺铁模型,研究铁缺乏对肠道发育的危害。选用新生哺乳仔猪补充不同来源铁,揭示肌注补铁对哺乳仔猪肠道发育和屏障功能的作用机制,比较口服无机铁（FeSO4）和氨基酸螯合铁（FebisGly）对肠道生理调控作用。试验一:选择去铁胺（DFO）处理诱导猪空肠上皮细胞系（IPEC-J2）缺铁。试验结果发现,50μM和100μM DFO处理6 h、12 h和24 h时,两处理组IPEC-J2细胞活力无显著差异（P>0.05）。50μM DFO处理36和48 h,IPEC-J2细胞活力显著降低（P<0.05）。50μM DFO处理36和48 h,IPEC-J2细胞Ferritin-H表达显著降低（P<0.05）。50μM DFO处理36 h,细胞增殖率降低。50μM DFO处理48 h,上皮细胞Cas-3,Cas 9和Bax m RNA表达显著增加（P<0.05）,细胞凋亡显著增加（P<0.05）。50μM和100μM DFO处理12 h显著降低细胞层跨膜电阻值（P<0.05）。结果表明,铁缺乏程度增加,通过逐步抑制肠上皮细胞增殖,诱导上皮细胞凋亡,降低肠上皮细胞层通透性,影响肠道细胞发育。试验二:选取体重相近（1.7±0.1 kg）的16头新生哺乳仔猪（0日龄）分为两组,分别于仔猪出生第3天肌肉注射100 mg Fe/m L的右旋糖苷铁1 m L或等量的生理盐水。仔猪由泌乳母猪代养,于断奶前（出生第21天）屠宰采样分析。结果发现:（1）肌注补铁对生长性能无差异影响（P>0.05）,补铁组血清铁（SI）、血红蛋白（HB）、平均红细胞体积（MCV）、平均血红蛋白含量（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）显著增加（P<0.05）。同时,补铁组仔猪十二指肠和回肠Ferritin-H和Ferritin-L蛋白表达显著上调（P<0.05）。（2）补铁组十二指肠和回肠绒毛高度显著增加（P<0.05）,十二指肠隐窝深度和绒毛/深度比值显著增加（P<0.05）。（3）基因转录组图谱和信号通路分析结果表明,补铁促进肠道上皮细胞周期和DNA复制过程。进一步地研究发现,补铁显著促进AKT、p-AKT和m TOR信号通路蛋白表达（P<0.05）。（4）补铁显著抑制十二指肠、回肠Claudin 1和Occludin蛋白表达,显著增加结肠杯状细胞数量和Muc2 m RNA表达,显著增加结肠IL-4和IL-10蛋白表达（P<0.05）。由此可知,肌注补铁提高哺乳仔猪肠道铁水平,通过AKT、m TOR通路促进肠道上皮发育。此外,补铁显著增加紧密连接、黏液产生和抗炎因子表达。试验三:选取体重相近（1.7±0.1 kg）24头新生哺乳仔猪（0日龄）分为三组,按25 mg Fe/d,分别于出生第2、7、12和17天灌服四次FeSO4、FebisGly和等剂量的生理盐水,比较无机铁FeSO4和有机铁FebisGly对哺乳仔猪铁利用率和肠道屏障功能的差异调节作用。仔猪按正常饲养,于第21天屠宰采样分析。结果表明:（1）FeSO4和FebisGly显著改善仔猪铁水平和肠道铁吸收转运相关基因（P<0.05）。（2）与FeSO4相比,FebisGly组CHOL和HDL-C含量显著增高,TG/CHOL显著降低（P<0.05）。FebisGly组十二指肠GSH含量显著增加,MDA含量显著降低（P<0.05）。（3）十二指肠转录图谱分析表明,FeSO4和FebisGly之间的显著差异基因主要影响肠道维生素和矿物元素吸收、p53信号通路、氧化磷酸化、细胞周期、Fox O信号通路和Hippo信号通路等。与FeSO4相比,FebisGly组显著增加仔猪十二指肠FOXO3和p-AMPK蛋白表达（P<0.05）。（4）结肠微生物区系分析表明,FeSO4和FebisGly组的肠道菌群多样性存在显著差异。与对照组和FebisGly相比,FeSO4组盲肠微生物群的α多样性（OUT、Chao1、辛普森和香农指数）显著降低（P<0.05）。β多样性分析表明,门水平上,FeSO4组结肠梭杆菌门（Fusobacteria）丰度显著增加（P<0.05）。与FeSO4相比,FebisGly组结肠微生物门水平上的厚壁菌门（Firmicutes）丰度显著增加、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（proteobacteria）丰度显著降低（P<0.05）。在属水平上,FebisGly组克里斯滕森菌属（Christensenellaceae＿R-7＿group）、瘤胃菌属（Ruminococcaceae＿UCG-002、Ruminococcaceae＿UCG-005）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium＿sensu＿stricto＿1）和地孢杆菌（Terrisporobacter和Lachnoclostridium）显著增加（P<0.05）。（5）结肠内容物靶向代谢组研究表明,FebisGly组结肠中石胆酸（LCA）、熊脱氧胆酸（UDCA）、甘氨石胆酸（GLCA）和甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA）显著增加。RDA分析表明,FeSO4组TG水平与Fusobacteria丰度相关,FebisGly组UDCA和GLCA变化与Ruminococcaceae＿UCG-002和Ruminococcaceae＿UCG-005丰度相关,HDCA变化与Christensenellaceae＿R-7＿group和Clostridium＿sensu＿stricto＿1丰度相关。由此可知,FeSO4和FebisGly显著改善铁水平和十二指肠铁吸收转运。FeSO4增加肠道有害微生物丰度的风险,而FebisGly降低肠道MDA水平,提高肠道AMPK/FOXO3表达和GSH水平,调节肠道微生物组成和次级胆汁酸的生成。综上所述,铁缺乏抑制猪肠细胞增殖,增加肠细胞凋亡。肌注补铁促进哺乳仔猪肠道上皮发育、紧密连接、黏液产生和免疫防御屏障功能。口服FeSO4和FebisGly均显著改善仔猪铁水平和肠道发育。与FeSO4相比,FebisGly促进肠道AMPK/FOXO3通路信号通路转导,增强肠道抗氧化能力,调节肠道菌群结构和次级胆汁酸代谢,更利于改善仔猪肠道健康。