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前言拟除虫菊酯(pyrethroid, PD)是根据天然除虫菊素的结构人工合成的农药,因具有广谱、高效、低毒、低残留等特点而被广泛应用。大量研究表明,该类药物属于神经毒物,中毒时主要表现为中枢神经系统的强烈兴奋症状。以往对PD神经毒性研究主要集中在膜电压依赖性离子通道、信号传导及中枢神经递质等多个靶位点上。研究发现,PD可致脑内兴奋性神经递质谷氨酸(glutamate, Glu)含量增加,与突触后膜上的谷氨酸受体的结合明显增多,进而引发一系列生化级联反应,最终导致细胞凋亡。而PD如何致突触间隙Glu增多至今尚未阐明。Glu是中枢神经系统中兴奋性突触传递的主要神经递质。星形胶质细胞和神经元之间形成的谷氨酸-谷氨酰胺(glutamate-glutamine, Glu-Gln)环路是脑内Glu代谢的主要途径,谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)和谷氨酰胺酶则是此环路中合成和水解Glu的关键酶。释放致突触间隙的Glu主要通过谷氨酸转运体-1(glutamate transporter-1, GLT-1)以重摄取方式清除而维持间隙内Glu的正常浓度。因此,Glu-Gln环路在PD致Glu递质传递紊乱的兴奋性神经毒性中起着至关重要的作用。此外,星形胶质细胞数量约为神经元的10倍,并且介于神经元和毛细血管之间,是血脑屏障的重要组成部分,血液中的PD或代谢产物只有通过星形胶质细胞才能作用于神经元。因此,PD致突触间隙Glu增多可能与清除功能下降有关,星形胶质细胞内的GS和(或)其膜上的GLT-1可能是PD干扰Glu-Gln环路代谢的关键环节。研究发现,溴氰菊酯染毒大鼠海马和皮质突触体GLT-1对Glu的摄取功能降低,但作用机制尚不清楚,有关PD对Glu-Gln环路干扰的详细研究也未见报道。乙体氯氰菊酯(beta-cypermethrin,β-CP)又名高效氯氰菊酯,是目前应用较为广泛的Ⅱ型PD类农药。因此,本研究通过β-CP对大鼠脑组织Glu-Gln环路干扰的研究,探讨PD兴奋性神经毒性及其作用机制,为该类农药的中毒防治提供科学依据。材料与方法一、动物分组及染毒健康成年Wistar大鼠按体重随机分为4组,每组10只,雌雄各半。以一次经口灌胃方式分别给予0、20、40、80mg／kg剂量的β-CP，灌胃量为0.5ml／100g体重。以食用色拉油稀释受试物质,对照组给予等量色拉油。实验期间自由摄食及饮水,4h后乙醚麻醉处死大鼠,分离大鼠脑组织供试。二、观察指标及检测方法(一)症状观察染毒后连续观察并记录大鼠中毒状况出现的时间、中毒表现及死亡情况。(二)Glu及Gln水平应用分光光度法按试剂盒说明进行测定。(三)GS活性及GLT-1的蛋白表达1、GS活性用预冷生理盐水将脑组织制成1％匀浆液,超声处理后参照文献测定脑组织GS活性。考马斯亮蓝法测定蛋白含量。GS活性检测结果以每分钟每毫克组织蛋白催化生成的γ-谷氨酰异羟肟酸的nmol数表示。2、GLT-1的蛋白表达利用RIPA蛋白裂解液提取脑组织总蛋白,紫外分光光度计测定所提蛋白溶液浓度。经聚丙烯酰胺凝胶电泳,转印,封闭,TBS-T洗膜,一抗40℃过夜,TBS-T洗膜,二抗孵育2h,TBS-T洗膜,ECL法显色成像。利用图像分析软件,用所测蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量。(四)GS、GLT-1的mRNA表达用TRIzol试剂提取脑组织中的总RNA,按RT-PCR试剂盒说明逆转录并扩增GS、GLT-1 mRNA。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像分析照相,利用软件分析各条带的灰度值,以各目的基因产物灰度值与β-actin灰度值的比值作为各目的基因的相对表达水平。三、统计分析实验结果用(?)±s表示,用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,组间两两比较用LSD法,检验水准α=0.05。结果一、症状观察80mg／kg剂量组全部大鼠于染毒1h后出现舔身、不安、抓搔等轻微兴奋症状,2h后陆续出现流涎、痉挛、共济失调等中毒症状,其中1只雌鼠出现濒死状态；40mg／kg剂量组个别大鼠于染毒2h后出现轻微兴奋症状；20mg／kg剂量组大鼠在整个受试期间未见异常。实验期间无动物死亡。二、Glu及Gln水平大鼠脑组织Glu水平随染毒剂量的增加而逐渐增加。统计结果表明,80mg／kg剂量组大鼠脑组织Glu水平明显高于对照组(P<0.05)；20、40mg／kg剂量组大鼠脑组织Glu水平虽高于对照组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。各染毒组大鼠脑组织Gln水平与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。三、GS活性及GLT-1的蛋白表达β-CP染毒大鼠脑组织GS活性随着染毒剂量的增加而逐渐降低,其中80mg／kg剂量组大鼠脑组织GS活性明显低于对照组(P<0.05)；20、40mg／kg剂量组大鼠脑组织GS活性虽低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。统计结果表明,各染毒组大鼠脑组织GLT-1蛋白表达与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。四、GS、GLT-1的mRNA表达各组大鼠脑组织中GS、GLT-1 mRNA相对表达量的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论β-CP可干扰大鼠脑组织Glu-Gln环路代谢,使大鼠脑组织Glu水平增高,GS活性可能是该类药物干扰Glu-Gln环路的毒作用靶点。