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目的:树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是体内功能最强的抗原提呈细胞。活化的DCs被认为是银屑病发病的上游环节,其分泌的IL-12及IL-23可进一步促进Th1、Th17细胞的活化并分泌IL-17、IL-21、IL-22以及TNF-α等细胞因子,这些细胞因子可以诱发银屑病等多种自身免疫性炎症损伤。研究表明,银屑病患者皮损及外周血中IL-23的含量增多,以IL-23单抗治疗银屑病在临床上取得了良好的疗效,这为银屑病的研究及治疗提供了新的思路。"从血论治"是治疗银屑病的主要法则,而"血分蕴毒"是其病机核心。北京中医医院及北京市中医研究所提出银屑病血热证病位在血分,由热生毒是疾病发展的关键。治疗上在凉血的基础上加重解毒药的使用,形成了凉血解毒方,经临床验证,疗效肯定。本课题将结合动物实验和细胞实验,以凉血解毒方及君药紫草的有效成分β,β—二甲基丙烯酰阿卡宁(β,β-dimethylacryloyl alkannin,DMA)进行干预,观察其对咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)诱导的银屑病样小鼠模型的干预作用,同时观察DMA对人外周血单核细胞及小鼠骨髓来源的DCs活化及功能的影响,明确药物的作用靶点及作用机制,为临床用药提供理论依据。方法:将Balb/c雄性小鼠随机分为6组:正常对照组(Ctrl)(灌服生理盐水及外涂凡士林,1次/天,共6天)、模型组(IMQ)(灌服生理盐水及外涂4%IMQ乳膏42mg制备银屑病样皮损,1次/天,共6天)、凉血解毒方高、中、低剂量组(LXJD-H、LXJD-M、LXJD-L)(灌服按成人剂量折算为小鼠剂量的中药复方水煎剂及外涂咪喹莫特乳膏同IMQ组,1次/天,共6天),DMA高剂量组(DMA-High,DMA-H)(灌服12mg/Kg浓度的DMA溶液及外涂咪喹莫特乳膏同IMQ组,1次/天,共6天),DMA中剂量组(DMA-Middle,DMA-M)(灌服6mg/Kg浓度的DMA溶液及外涂咪喹莫特乳膏同IMQ组,1次/天,共6天),DMA低剂量组(DMA-Low,DMA-L)(灌服3mg/Kg浓度的DMA溶液及外涂咪喹莫特乳膏同IMQ组,1次/天,共6天)、阳性对照组(甲氨蝶呤MTX)(灌服1mg/Kg浓度甲氨蝶呤溶液及外涂咪喹莫特乳膏同IMQ组,1次/天,共6天)。每日观察小鼠背部皮损变化,使用临床银屑病皮损面积和疾病严重程度(Psoriasis Area and Severity Index,PASI)评分标准进行评分,于给药第6天取材,光镜下观察皮损组织形态学变化、测量表皮层厚度;免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)反映表皮角质形成细胞增殖程度;检测皮损中Ki67,并反映细胞增殖活跃程度;检测皮损中CD11c的表达量,反映树突状细胞数量;流式细胞术检测脾脏CD11c+细胞比例;RT-PCR法检测皮损中IL-23、IL-12、IL-1β等相关细胞因子mRNA的表达水平,Western Blot法检测TLR7/8信号通路相关蛋白的表达。采用人外周血单核细胞及小鼠骨髓细胞经GM-CSF及IL-4诱导培养DCs,磁珠分选得到纯化的CD1a+DCs及CD11c+DCs。将细胞分空白对照组(Ctrl)、模型组(R848 10μg/ml刺激24h)、给药组:DMA 12.5μg/ml,10μg/ml,5μg/ml,2.5μg/ml。CCK-8法检测药物对细胞活性的影响;流式细胞仪检测药物对DCs表面成熟标志分子表达的影响;RT-PCR检测药物对细胞分泌细胞因子IL-6、IL-12、IL-10、IL-1β、IL-23、TNF-αmRNA表达;Western Blot检测药物对细胞TLR7/8、NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。结果:1.IMQ组小鼠皮肤出现红斑、鳞屑、皮肤增厚等类似银屑病样皮损。与IMQ组比较,LXJD-H、LXJD-M、LXJD-L组小鼠皮损症状缓解,PASI评分降低,表皮层厚度降低(P<0.001),表皮角化不全减轻,角质形成增殖减少,CD11c+树突状细胞数量减少(P<0.05),其中以LXJD-L组疗效最为明显。2.与IMQ组小鼠比较,DMA-H、DMA-M、DMA-L组小鼠银屑病样皮损症状缓解,PASI评分降低,表皮层厚度降低(P<0.05),表皮角化不全减轻,角质形成增殖减少,其中以DMA-L组疗效最为明显。进一步检测发现,DMA-L组小鼠皮损及脾脏中CD11c+的数量减少(P<0.01),皮损中IL-23、IL-1β、IL-12mRNA的表达降低(P<0.05,P<0.01,P<0.05),皮损中TLR8、MyD88蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。3.经流式鉴定,人外周血单核细胞来源的树突状细胞CD1a阳性表达率为94.3%,细胞经R848刺激后,CD80、CD83表达增加(P<0.01,P<0.05);促进同种异体T淋巴细胞增殖的能力增强(P<0.05);IL-6、IL12-p40、IL-1β、TNF-α及IL-23mRNA的表达升高(P<0.01),IL-1OmRNA的表达降低(P<0.05);细胞分泌的IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α及IL-23等细胞因子含量升高(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01);12.5μg/mlDMA可抑制树突状细胞促进T细胞增殖的作用(P<0.05);抑制细胞IL-12p40、IL-1β、TNF-α、IL-23mRNA的表达(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.01),升高IL-10mRNA表达(P<0.01);抑制IL-1β、TNF-α、IL-23、IL-10细胞因子分泌(P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05);4.经流式鉴定,小鼠骨髓来源的树突状细胞CD11的阳性表达率为91.93%,细胞经R848刺激后,细胞表面分子I-E/I-A、CD80、CD86表达升高(P<0.01),细胞促炎性细胞因子IL>-1β、IL-23、IL-12mRNA的表达增加(P<0.01,P<0.05,P<0.001),促炎性细胞因子IL-1β及IL-23的分泌增加(P<0.001,P<0.01),细胞可促进CD4+T细胞T-bet、RORyT、Foxp3 mRNA的表达(P<0.01,P<0.05,P<0.05),细胞TLR7、TLR8、MyD88、IRAKM、p-IRF7、p-p65、p-stat3、μ-stat6等蛋白表达增加(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.01);DMA 10、5、2.5μg/ml 可抑制细胞表面 I-E/I-A 的表达(P<0.05,P<0.01,P<0.01),DMA5、2.5pg/ml可抑制细胞表面CD80的表达(P<0.01,P<0.05),DMA5μg/ml可抑制细胞表面CD86的表达(P<0.05),DMA10μg/ml可抑制细胞IL-1βmRNA的表达(P<0.05),DMA5、2.5μg/ml可抑制细胞IL-12p40mRNA的表达(P<0.01,P<0.001),DMA10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml可抑制细胞因子IL-1β的分泌(P<0.001,P<0.001,P<0.01),抑制IL-23细胞因子的分泌(P<0.01);DMA10μg/ml可抑制细胞因子IL-12的分泌(P<0.05),DMA 10μg/ml可抑制树突状细胞诱导T细胞向Th1、Th17及Treg分化的作用(P<0.01,P<0.01,P<0.05),DMA10μg/ml、5μg/ml可抑制细胞TLR7、TLR8、MyD88、P-p65、P-stat3、P-stat6蛋白的表达(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.001,P<0.05),DMA10μg/ml可抑制细胞IRAKM蛋白的表达(P<0.05)。结论:1.凉血解毒方可显著改善IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损,抑制表皮细胞增生、异常分化、炎症细胞浸润等银屑病样病理表现,降低皮损中CD11c+树突状细胞含量。2.凉血解毒方中君药紫草的有效成分β,β—二甲基丙烯酰阿卡宁可显著改善IMQ诱导的银屑病样皮损,抑制表皮细胞增生、异常分化、炎症细胞浸润等银屑病样病理表现,降低模型皮损及脾脏中树突状细胞的含量,抑制皮损树突状细胞分泌IL-23的能力,其作用机制可能是抑制了 TLR8信号转导通路的活化。3.β,β一二甲基丙烯酰阿卡宁对体外培养的人外周血单核细胞来源的树突状细胞成熟及功能具有抑制作用,并可通过抑制TLR7/8信号通路及下游NF-κB途径的活化抑制小鼠骨髓来源的树突状细胞的成熟及功能,这可能是其治疗银屑病的机制之一。4.β,β—二甲基丙烯酰阿卡宁可作为TLR7/8的拮抗剂,为治疗与银屑病发病机制类似的自身免疫性疾病提供了的思路。