论文部分内容阅读
大量研究表明过量的活性氧能够诱发癌症、心血管疾病、糖尿病、神经系统疾病和阿尔茨海默病等多种疾病。当机体抗氧化能力下降或者防御系统受损时,机体将无法清除过量活性氧,需要通过外源性抗氧化剂协助清除过量活性氧。人工合成抗氧化剂在过量添加或不正确添加时会对机体造成伤害,且具有副作用甚至致癌作用,筛选和评价具有强抗氧化活性的天然物质已成为生物、医学和食品科学研究的新趋势。天然抗氧化剂,其原料来源广泛,在抗氧化特性方面具备高效和安全等优势。因此,本研究以燕麦为原料,采用酶解法制备燕麦抗氧化肽,通过超滤法和凝胶柱层析法对其进行分离纯化,采用质谱法对获得的抗氧化肽序列进行鉴定和分析,并利用Peptide Ranker数据库对鉴定到的肽段进行活性筛选,再通过建立H2O2诱导的人肝癌细胞HepG2细胞氧化应激模型考察燕麦抗氧化肽对HepG2细胞氧化损伤的保护作用,最后通过高通量转录组学方法初步分析了燕麦抗氧化肽预防氧化损伤的分子机制。研究结果如下:（1）采用超滤法分离纯化燕麦多肽得到四个肽组分,分别是OP-Ⅰ（MW＞5 k Da）、OP-Ⅱ（3 k Da＜MW＜5 k Da）、OP-Ⅲ（1 k Da＜MW＜3 k Da）、OP-Ⅳ（MW＜1 k Da）,其中OP-Ⅳ的抗氧化活性最强,其清除DPPH·、ABTS+自由基的IC50值分别是2.25和0.098 mg/m L,在浓度是5 mg/m L时的还原力为0.52;采用葡聚糖凝胶G-15分离OP-Ⅳ,获得三个组分OP-ⅣA、OP-ⅣB和OP-ⅣC,其中OP-ⅣC的抗氧化活性最强,清除DPPH·、ABTS+自由基的IC50值分别是0.175和0.030 mg/m L,在浓度5 mg/m L时还原力为0.64;利用Q-Exactive plus对OP-ⅣC进行氨基酸序列鉴定,经Peptide Ranker数据库进行生物活性预测,获得得分最高的两条肽段是OP-1和OP-2,其氨基酸序列分别是His-Trp-Pro-Leu-Pro-Pro-Phe（892.46 Da）和Gly-Trp-Leu-Asp-Arg-Phe-Pro-Met-Phe（1167.55 Da）。（2）以浓度为0.8 m M的H2O2刺激HepG2细胞建立氧化应激模型,并进行OP-1和OP-2对细胞氧化损伤保护能力的研究。结果显示:浓度范围为0.06-1.0 mg/m L的OP-1和OP-2预处理24 h对细胞均无毒性作用,其中浓度为1.0 mg/m L的OP-1和OP-2的保护作用最强,但OP-1和OP-2组间无明显差异（p＞0.05）。对HepG2细胞内的ROS、MDA、CAT、SOD和GSH-PX的测定结果表明,1.0 mg/m L的OP-1和OP-2能够显著降低HepG2细胞的ROS和MDA含量（p＜0.05）,并且能够显著提高CAT、SOD和GSH-PX的活力（p＜0.05）,初步表明OP-1和OP-2是两种新型抗氧化肽,能够有效清除活性氧,增强相关抗氧化酶的活性,保护细胞免受由细胞氧化应激带来的损伤。（3）转录组测序分析结果表明,OP-1、OP-2与模型组的差异表达基因GO功能主要注释到免疫过程、生长代谢和分子功能等方面,表明OP-1和OP-2可能通过调控生物过程、分子功能调节等过程发挥抗氧化作用以减轻细胞氧化损伤。KEGG分析发现,OP-1发挥抗氧化活性涉及的通路主要为Hippo信号通路和坏死性凋亡,差异表达基因Id2和SNAI2表达上调,可能通过抑制ROS诱导的细胞凋亡,减小氧化损伤;TLR4和CAMK2D表达下调,有利于减少坏死性凋亡,缓解氧化应激造成的损伤。OP-2可能通过雌激素信号通路和IL-17信号通路来发挥抗氧化作用,CALML6和CXCL2的表达上调,促进细胞增殖,降低细胞氧化应激水平。UGT1A7表达上调,说明OP-2的存在可能降低ROS对HepG2细胞的氧化损伤。FOS表达下调,表明OP-2降低了ROS水平,说明其对细胞氧化损伤具有一定的改善作用。