9E8是本实验室筛选获得的一株针对人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus,HIV)的鼠源抗体,其亲和力为3.23×10-10M,目前已经成功应用到本实验室开发的HIV诊断试剂盒中,但其灵敏度和特异性都还有待提高。　　 本研究的目的就是利用噬菌体展示技术对HIV诊断抗体9E8进行亲和力成熟,进一步提高HIV诊断的灵敏度和特异性。首先,用RT-PCR的方法从杂交瘤细胞中调取鼠源抗体9E8的可变区基因,将其构建成单链抗体VH-(G4S)3-VL的形式,展示到噬菌体pⅢ蛋白上,并验证ScFv的活性。确定噬菌体ScFv具有结合活性后,用CDR替换的方法,确定抗体抗原结合的关键CDR区。将9E8-ScFv的VH和VL氨基酸序列分别输入到NCBI数据库中,按照骨架区同源度最高而CDR氨基酸序列差异最大的原则,搜寻人源抗体的CDR序列作为CDR替换序列,每个9E8-ScFv中的CDR对应2种替换序列。CDR替换后,用Elisa方法检测活性,最终确定了三个关键CDR区,即:HCDR2、HCDR3和LCDR3。　　 确定了抗体抗原结合的关键CDR区之后,接下来就是对关键CDR区实施单点突变,以此获得每个关键CDR区的突变热点及其氨基酸变化规律。根据突变热点及其氨基酸变化规律,设计简并引物,构建了3个亲和力成熟初级噬菌体文库HCDR2、HCDR3和LCDR3,库容大小分别为2.0×109、1.66×109和1.68×108。以p24作为抗原,用固相筛选的方法对初级噬菌体文库进行筛选,每个初级库筛选三轮,并分别挑取一定数目的单克隆菌落进行检测。再以初级噬菌体文库筛选三轮后的多样性克隆序列为模板,进一步构建亲和力成熟次级噬菌体文库9E8HK(库容:8×100),用更加苛刻的筛选条件对其进行筛选。然后,挑取800个单克隆菌落进行检测,并用ScFv竞争的方法对高亲和力噬菌体单链抗体进行初步筛选,最终8个结合活性最好的克隆进行真核表达,得到了一株亲和力提高5.7倍的抗体9E8HK-491,其亲和力达到5.64×10-11M。　　 最后,对抗体9E8HK-491进行灵敏度和特异性的评估,结果都有了很明显的提高,是一株具有潜在应用价值的抗体。