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锌离子是细胞生命活动中不可缺少的重要金属离子,也是细胞内的一种信号离子,参与了细胞的多项生理生化功能,对人体健康有着极其重要的作用。荧光探针在研究生命体内离子浓度引起的生理效应变化中有着广阔的前景。现在开发出来的锌离子探针多为化学小分子类荧光探针,虽然它们现在已经被用于锌离子的检测和成像中,但是它们有很大缺陷,如不易导入活细胞、不具靶向性、对正常细胞生理功能有影响等。而荧光蛋白小分子探针却能很好地解决这些问题,它可以很容易通过基因转染在活细胞中表达、用基因工程的方法靶定到细胞的特定部位活体成像、对细胞的生理功能影响很小。采用荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)技术的荧光蛋白探针可以对活细胞中的实时信号转导过程及小分子进行检测和成像,典型代表是钙离子成像探针Cameleon,而锌离子探针还处于初步的研发及完善阶段。为了能特异性检测锌离子,我们就设计了一种基于荧光共振能量转移技术利用金属硫蛋白来检测锌离子的荧光蛋白探针。本文主要是通过基因工程的方法构建体外原核表达荧光蛋白探针质粒载体pET28a(+)-ECFP-GGS-MT2A-a-GGSGG-cpCitrine174和真核体内荧光蛋白探针表达载体pCDNA3.1 (+)-ECFP-GGS-MT2A-a--GGSGG-cpCitrine 174:其基本设计是在MT2Aa蛋白亚基两端加入一对能产生FRET的荧光蛋白ECFP和cpCitrine174(重组环化突变的YFP),中间分别加入连接肽GGS和GGSGG,利用质粒pET28a(+)和pCDNA3.1(+)作为原核与真核表达载体,将以pET28a(+)为载体的质粒转化表达菌株BL21 (DE3),经IPTG诱导表达,过Ni+柱纯化得到探针融合蛋白,并进行体外ITC和荧光光谱仪检测实验；将以pCDNA3.1(+)为载体的质粒瞬时转染HeLa细胞培养,并用荧光倒置显微镜进行成像分析并进行活细胞锌离子测定实验。实验表明,我们成功构建并在大肠杆菌中高效表达了锌离子荧光蛋白探针,有25mg·L-1的得率,纯度为74.8%,可以很方面进行体外测定实验。通过ITC实验测定探针对Zn2+和Cu2+体外结合实验,表明该探针在体外对Zn2+更具有亲和性。探针体外与各种金属离子反应荧光光谱检测表明,探针可对锌离子相对特异地作出高效反应,当加入过量锌离子后,探针释放的光谱在475nm处有明显的下降,而在527nm处有明显的升高,其动态范围Rmax/Rmin为3.0,我们设计的这个探针动态范围很大,灵敏度很高；虽然其他金属离子仍能引起探针一定程度的FRET荧光强度变化,但一般在活细胞中这些重金属离子浓度非常低,不会明显影响活细胞内探针对锌离子的检测。通过竞争性实验,我们发现加入其他金属离子后,该探针对锌离子的反应的荧光强度比值没有多大变化,说明其他金属离子不会明显影响该探针和锌离子的反应。而活细胞内锌离子荧光蛋白探针用于锌离子的成像实验让我们看到,整个HeLa细胞在这个实验过程中荧光强度比率发生了明显的变化,说明活细胞内锌离子荧光蛋白探针对Zn2+有很好地反应。最后,我们依据钙离子探针设计经验,推算出细胞内锌离子荧光蛋白探针测定游离锌离子浓度的公式,据此,可以利用该探针计算出活细胞内游离锌离子的浓度。