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背景与目的:
SCML2(Sex comb on midleg-like protein 2)为果蝇SCM(Sex comb on midleg)的同源蛋白,是多梳抑制复合体1(Polycomb repressive complex 1,PRC1)的组成亚基。PRC1能够通过抑制特异基因的表达,调控干细胞的更新、分化和发育,并在肿瘤发生中发挥重要功能。SCML2作为PRC1的组成亚基之一,在小鼠中只在睾丸组织中表达,在小鼠精子发生过程中前期抑制体细胞基因的表达,而在后期减数分裂过程中该蛋白会在性染色体上积累,参与调控性染色体连锁基因的表达,保证精子发生过程中特异性基因的激活。小鼠和人源SCML2的基因序列保守性较差,表明SCML2在人体中可能拥有其他功能。
DNA稳定性对细胞非常重要,DNA的损伤会诱导多种细胞反应,包括激活DNA损伤修复和细胞周期检验点等。其中细胞周期检验点的激活能够使细胞周期停滞,从而有足够的时间修复DNA损伤,维持基因组的稳定性。在哺乳动物细胞中,PRC1相关蛋白除参与抑制基因表达外还可参与控制细胞增殖、DNA损伤修复及肿瘤形成。本文的研究目的是探究SCML2是否参与DNA损伤修复及细胞周期调控,并尝试找出其中的分子机制。
实验方法:
通过串联亲和纯化和蛋白质质谱实验检测发现SCML2的相互作用蛋白,并通过免疫共沉淀、体外GSTpull-down实验对质谱分析结果进行验证。通过免疫荧光染色技术,研究SCML2在细胞内的定位特征。利用DNA损伤药物诱导细胞发生DNA损伤,以检测SCML2在DNA损伤中的作用。通过流式细胞术检测SCML2在细胞周期调控中的作用。通过克隆形成实验检测细胞在DNA损伤后的存活能力。
结果:
首先,通过免疫印迹技术检测,我们发现SCML2在多种肿瘤细胞中均可以表达,并阐述两种mRNA剪切形式:SCML2A和SCML2B,表明SCML2在人体中拥有不同于小鼠的蛋白分布。SCML2A和SCML2B都能通过泛素-蛋白酶体途径被降解,但蛋白稳定性不同,SCML2B比SCML2A更易被降解。我们还发现干涉SCML2表达会导致细胞生长速率加快,影响细胞周期,同时使细胞对DNA损伤药物更敏感。进一步对该蛋白在DNA损伤中发挥功能的机制进行研究发现,DNA损伤会诱导SCML2的Ser570发生磷酸化修饰,说明SCML2在DNA损伤修复过程中发挥作用。通过质谱分析与SCML2发生相互作用的蛋白发现,该蛋白与USP7蛋白之间存在很强的相互作用。而介导这两种蛋白相互作用的关键结构域分别为SCML2的DUF3588结构域和USP7蛋白N端的TRAF结构域。最后,我们发现干涉SCML2后,肿瘤细胞中p53的蛋白表达量升高。
结论:
本研究发现,和SCML2在小鼠中只存在于睾丸组织不同,SCML2在人体多种肿瘤细胞中表达,并主要以两种异构体SCML2A和SCML2B的形式存在。SCML2A和SCML2B均可以发生泛素化修饰并通过泛素-蛋白酶体途径被降解,但蛋白间稳定性存在差异,SCML2B更易被降解。我们还发现SCML2可以参与DNA损伤修复并调控细胞周期进程,进而影响DNA损伤后细胞的存活。在对该现象形成的机制进行研究后,我们初步发现DNA损伤后SCML2的Ser570位点发生磷酸化修饰,另外SCML2可以与USP7的N端TRAF结构域结合,可能通过竞争结合机制调节p53蛋白的稳定性,进而以p53依赖途径参与调控DNA损伤修复及细胞检查点的激活。本研究为阐明SCML2在人源细胞中的功能提供了新的线索。
SCML2(Sex comb on midleg-like protein 2)为果蝇SCM(Sex comb on midleg)的同源蛋白,是多梳抑制复合体1(Polycomb repressive complex 1,PRC1)的组成亚基。PRC1能够通过抑制特异基因的表达,调控干细胞的更新、分化和发育,并在肿瘤发生中发挥重要功能。SCML2作为PRC1的组成亚基之一,在小鼠中只在睾丸组织中表达,在小鼠精子发生过程中前期抑制体细胞基因的表达,而在后期减数分裂过程中该蛋白会在性染色体上积累,参与调控性染色体连锁基因的表达,保证精子发生过程中特异性基因的激活。小鼠和人源SCML2的基因序列保守性较差,表明SCML2在人体中可能拥有其他功能。
DNA稳定性对细胞非常重要,DNA的损伤会诱导多种细胞反应,包括激活DNA损伤修复和细胞周期检验点等。其中细胞周期检验点的激活能够使细胞周期停滞,从而有足够的时间修复DNA损伤,维持基因组的稳定性。在哺乳动物细胞中,PRC1相关蛋白除参与抑制基因表达外还可参与控制细胞增殖、DNA损伤修复及肿瘤形成。本文的研究目的是探究SCML2是否参与DNA损伤修复及细胞周期调控,并尝试找出其中的分子机制。
实验方法:
通过串联亲和纯化和蛋白质质谱实验检测发现SCML2的相互作用蛋白,并通过免疫共沉淀、体外GSTpull-down实验对质谱分析结果进行验证。通过免疫荧光染色技术,研究SCML2在细胞内的定位特征。利用DNA损伤药物诱导细胞发生DNA损伤,以检测SCML2在DNA损伤中的作用。通过流式细胞术检测SCML2在细胞周期调控中的作用。通过克隆形成实验检测细胞在DNA损伤后的存活能力。
结果:
首先,通过免疫印迹技术检测,我们发现SCML2在多种肿瘤细胞中均可以表达,并阐述两种mRNA剪切形式:SCML2A和SCML2B,表明SCML2在人体中拥有不同于小鼠的蛋白分布。SCML2A和SCML2B都能通过泛素-蛋白酶体途径被降解,但蛋白稳定性不同,SCML2B比SCML2A更易被降解。我们还发现干涉SCML2表达会导致细胞生长速率加快,影响细胞周期,同时使细胞对DNA损伤药物更敏感。进一步对该蛋白在DNA损伤中发挥功能的机制进行研究发现,DNA损伤会诱导SCML2的Ser570发生磷酸化修饰,说明SCML2在DNA损伤修复过程中发挥作用。通过质谱分析与SCML2发生相互作用的蛋白发现,该蛋白与USP7蛋白之间存在很强的相互作用。而介导这两种蛋白相互作用的关键结构域分别为SCML2的DUF3588结构域和USP7蛋白N端的TRAF结构域。最后,我们发现干涉SCML2后,肿瘤细胞中p53的蛋白表达量升高。
结论:
本研究发现,和SCML2在小鼠中只存在于睾丸组织不同,SCML2在人体多种肿瘤细胞中表达,并主要以两种异构体SCML2A和SCML2B的形式存在。SCML2A和SCML2B均可以发生泛素化修饰并通过泛素-蛋白酶体途径被降解,但蛋白间稳定性存在差异,SCML2B更易被降解。我们还发现SCML2可以参与DNA损伤修复并调控细胞周期进程,进而影响DNA损伤后细胞的存活。在对该现象形成的机制进行研究后,我们初步发现DNA损伤后SCML2的Ser570位点发生磷酸化修饰,另外SCML2可以与USP7的N端TRAF结构域结合,可能通过竞争结合机制调节p53蛋白的稳定性,进而以p53依赖途径参与调控DNA损伤修复及细胞检查点的激活。本研究为阐明SCML2在人源细胞中的功能提供了新的线索。