鸡蛋污染致病菌的分离鉴定及其LAMP技术快检方法的研究

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食品安全已经成为全世界关注的焦点问题,食源性致病菌造成的食品污染是产生食品安全问题的主要原因。常见的食源性致病菌主要有出血性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄葡萄球菌、霍乱弧菌和蜡样芽孢杆菌等。鸡蛋是公认的营养食品,我国的人均消耗量逐年提升。但近些年,鸡蛋却经常出现安全问题,特别是致病菌微生物的污染给人民的身体健康和国民经济造成重大损失,因而成了国内外消费者关注的焦点。环介导等温扩增(LAMP,loop-mediated isothermal amplification)技术运用一套2对可以识别目的基因序列的6个特定区域引物,在恒定温度条件下(60-80℃)进行基因扩增。其操作具有设备简单、快速、特异性高等优点,是一种快速检测食品致病菌的核酸扩增技术,具有较高的应用价值。本论文从市售鲜鸡蛋表面分离纯化了4株细菌,通过形态、生理生化及16SrRNA基因片段测序分析,鉴定均为食源性常见致病菌:金黄色葡萄菌Staphylococcus aureus和蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。由此可见,金黄色葡萄菌和蜡样芽孢杆菌是市售鸡蛋常见污染致病菌之一。5组不同引物根据金黄色葡萄球菌特异性的耐热核酸酶nuc基因进行设计,其中1组引物被筛选出作为实验的特异性引物。通过特异性和灵敏性实验验证,表明该引物可以用于金黄色葡萄球菌的LAMP检测。影响LAMP法扩增的主要因素除了引物外,还有底物、Bst DNA聚合酶、扩增温度、扩增时间等。本文通过这些因素的单因素实验,最佳的反应体系及条件为:引物各0.5μl,Bst DNA聚合酶1μl(8U),dNTPs1μl,Betaine5μl(1.2M),反应温度64℃,反应时间60min,总体积25μl。本论文中金黄色葡萄球菌的最低检测浓度使用LAMP方法检测,最低浓度为102cfu/ml,而浓度梯度为101cfu/ml、100cfu/ml均未见LMAP扩增,参考PCR检测灵敏度的相关文献, PCR技术检测细菌的灵敏度一般也104cfu/ml至l02cfu/ml之间。由此可见,本实验所建立的LAMP检测方法检测金黄色葡萄球菌具有特异性强、灵敏性高、时间短等特点,对今后快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒的研发奠定了一定的研究基础。
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