论文部分内容阅读
蜜蜂是社会性昆虫,在营养、激素、基因、蛋白质、表观遗传等因素共同作用下,雌性蜜蜂逐渐分化成蜂王和工蜂两个不同的级型,在蜜蜂这个社会性群体中担任不同的社会职能。目前,雌性蜜蜂的级型分化机理还没完全弄清楚。为了进一步探究蜜蜂级型分化的机理,我们采集了意大利蜜蜂幼虫期72 h、84 h、96 h、120 h蜂王幼虫和工蜂幼虫的血淋巴,进行代谢物鉴定及代谢通路分析,找出了很多可能与蜜蜂级型分化有关的差异代谢物质。其中,幼虫期72 h、84 h、96 h、120 h蜂王相较于工蜂均差异的代谢物有439种,且这些代谢物主要富集在34条代谢通路上;蜂王幼虫期84 h、96 h、120 h相较于72 h均差异的代谢物有487种,且这些差异代谢物主要富集在24条代谢通路上;工蜂幼虫期84 h、96 h、120 h相较于72 h均差异的代谢物有540种,且这些差异代谢物主要富集在52条代谢通路上。我们根据前人研究结果,对蜜蜂体内880个转录因子进行分析,发现有501个转录因子在蜂王幼虫和工蜂幼虫间有表达差异。在这些转录因子中有348个仅在蜂王幼虫中上调表达,90个仅在工蜂幼虫中上调表达,另有63个既在某一时间点的蜂王幼虫体内上调表达,同时又在另一时间点的工蜂幼虫体内上调表达。本研究利用荧光定量PCR技术分析了AmE75、AmBrc、AmEHMT、AmFTZ、AmHR3这5个基因在幼虫期48 h、84 h、120 h意大利蜜蜂蜂王幼虫和工蜂幼虫体内的表达情况。结果显示AmE75基因的表达量在幼虫期84h时,蜂王幼虫显著高于工蜂幼虫(p<0.05)。AmBrc基因的表达量在幼虫期84 h时,蜂王幼虫显著高于工蜂幼虫(p<0.05),在幼虫期120 h时,蜂王幼虫显著低于工蜂幼虫(p<0.05)。AmEHMT基因和AmFTZ基因的表达量在幼虫期84 h和120 h时,蜂王幼虫均显著低于工蜂幼虫(p<0.05)。工、AmHR3基因的表达量在幼虫期48 h时,蜂王幼虫显著高于工蜂幼虫(p<0.05);在幼虫期84 h时蜂王幼虫显著低于工蜂幼虫(p<0.05)。国内外学者的研究表明雌性蜜蜂级型分化与Amdnmt3基因调控的DNA甲基化水平相关。本研究以意大利蜜蜂幼虫cDNA为模板,对意大利蜜蜂Amsp4基因进行克隆,该基因mRNA长为2614nt,编码831aa,由12个外显子和11个内含子组成。结构域分析表明Amsp4蛋白的C端具有3个C2H2锌指结构域。用荧光定量PCR技术分析幼虫期48h、84h、120 h三个时间点蜂王和工蜂体内Amdnmt3基因和Amsp4基因的相对表达量。结果表明:Amdnmt3基因和Amsp4基因的表达量在幼虫期48h和84h蜂王幼虫均显著低于工蜂幼虫(P<0.05),在幼虫期120 h蜂王幼虫和工蜂幼虫差异不显著(P>0.05)。本研究对意大利蜜蜂60 h工蜂幼虫注射Amsp4基因siRNA显著降低了工蜂幼虫Amsp4基因和Amdnmt3基因的相对表达量,且提高了羽化雌性蜜蜂的初生重、体长、第三背板长。为了探究Amdnmt3基因的转录调控机理。本研究通过5’RACE实验发现Amdnmt3基因存在多个转录起始位点并鉴定出5种不同的选择性剪切形式。对表达量最高的启动子进行双荧光素酶启动子转录活性检测,结果表明该启动子具有很高的转录活性。对该启动子序列分析发现有多个哺乳动物SP1/SP3基因结合位点。因而我们推测哺乳动物SP1/SP3蛋白在意大利蜜蜂中的同源体Amsp4可能结合到Amdnmt3基因启动子区调控其转录。本论文首次发现Amsp4基因可能通过调控Amdnmt3的转录进而调控雌性蜜蜂的发育。