杏鲍菇和云柚菇中抗病毒蛋白的分离纯化、理化性质及其生物活性

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通过硫酸铵分级沉淀、离子交换柱DEAE-Sepharose FF和凝胶Sephacryl S-200 High Resolution柱层析,从云柚菇(Agrocybe sp.)子实体干样中分离到一个抗病毒蛋白yy4a。SDS-PAGE确定其分子量为17 kDa。在枯斑寄主心叶烟上(Nicotiana glutinosa)检测该蛋白对烟草花叶病毒(TMV)侵染的抑制效果,得知yy4a对TMV(20μg/mL)侵染的抑制有效浓度为3.13μg/mL;同时发现yy4a蛋白显示出较强的血凝活性,当yy4a的初始浓度为1.5 mg/mL时对兔血红细胞的血凝滴度达2-9,乳糖和菊糖对其血凝活性有抑制效果;yy4a对人早幼粒白血病细胞HL-60也表现出强烈的凝集素效应,MTT法检测其抑制HL-60细胞增殖的半数致死浓度(IC50)为200.909μg/mL。 采用离子交换柱DEAE-Sepharose FF和凝胶层析柱Superdex75 Prep Grade层析从杏鲍菇(Pleurotus eryngii)鲜样中获得了另一抗病毒蛋白XB,经SDS-PAGE、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和等电聚焦电泳(IEF)电泳测定其分子量为22.3 kDa,仅含单一条带。该蛋白是含糖量极低的酸性单体蛋白,等电点为4.1。Western-Blot显示蛋白主要出现在杏鲍菇菌盖中。制备了XB蛋白兔抗血清,特异性较好,间接ELISA检测其效价为2-13。当XB蛋白的初始浓度为0.075mg/mL时对兔血红细胞的血凝滴度达2-3。 以半叶法在枯斑寄主心叶烟上检测该蛋白对20μg/mL TMV侵染的抑制效果,得知XB对TMV侵染的抑制有效浓度为4.69μg/mL。初步分析了抗病毒机理,叶圆片法检测XB蛋白对TMV复制没有抑制效果;XB蛋白在TMV接种前后处理叶片产生枯斑数差异不大;XB蛋白与TMV孵育后电镜观察显示XB蛋白均匀吸附在病毒粒子上;XB蛋白与TMV外壳蛋白混合后PAGE电泳表现出结合现象。这些证据表明XB蛋白可能是通过其与病毒外壳蛋白结合,导致病毒失去侵染力。 初步研究了XB蛋白对HL-60细胞的抑制作用,结果显示XB对HL-60的抑制作用随剂量的增大而增强,也随作用时间延长而增强,并推测其作用机理可能是诱导HL-60细胞凋亡。XB蛋白半数致死剂量(IC50)为15.261μg/mL,以其IC50为条件浓度,细胞计数法结果显示XB对HL-60作用的第5天抑制率为43.7%。
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