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目的：上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）为最常见的卵巢恶性肿瘤，不易早期诊断，复发及死亡率高。卵巢癌目前标准治疗方法主要为肿瘤细胞减灭术及以铂类为基础的化疗，但约70-80%的患者最终会出现化疗耐药，引起肿瘤的复发及转移，为卵巢癌治疗失败及患者死亡的重要原因，故其5年生存率一直徘徊在30%左右。因此，探讨化疗耐药肿瘤的侵袭转移机制，寻找有效的干预靶点，为EOC患者延长生存期和改善预后的迫切需求。近年来研究发现，上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）不仅参与胚胎发育及创伤修复，在肿瘤的侵袭转移过程中也发挥了重要作用。EMT是指特定的生理或病理情况下，上皮细胞丢失上皮表型的特性转化为间质表型细胞过程。发生EMT的细胞极性丢失，细胞间粘附力下降，运动能力增强，细胞形态延伸，抗凋亡能力增强，从而促进肿瘤侵袭转移。EMT与多种细胞因子、转录因子及信号通路相关。EMT过程伴随着Notch、Wnt、Hedgehog等多种信号通路的活化；转录因子Snail和Slug等表达上调；上皮表型标志物E-cadherin等表达下调，间质表型标志物vimentin等表达上调。此外，发生EMT的肿瘤细胞可获得自我更新等干细胞样特性，这可能与肿瘤细胞发生化疗抵抗相关。多年研究表明，Notch信号通路在多种实体肿瘤及血液系统肿瘤中均异常表达，且与肿瘤的发生发展密切相关。新近研究表明，Notch信号通路活化可诱导多种肿瘤细胞发生EMT，促进肿瘤的转移和复发。γ-分泌酶为激活Notch信号通路的核心环节，而成为肿瘤治疗的研究热点。本实验通过体外培养人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3及其顺铂耐药株SKOV3/DDP，检测其Notch1mRNA表达量的差异，并进一步研究γ分泌酶抑制剂DAPT作用于SKOV3/DDP细胞后，E-cadherin及vimentin的表达情况，以及其迁移及穿膜能力的改变。旨在从分子水平探讨DAPT能否通过抑制Notch信号通路，从而抑制化疗耐药EOC的侵袭转移能力，为化疗耐药EOC的治疗策略提供实验依据。方法：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃，饱和湿度5%CO2的恒温培养箱中常规培养人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3、及其顺铂耐药株SKOV3/DDP。取对数生长期细胞进行实验。1倒置显微镜观察SKOV3细胞及SKOV3/DDP细胞的形态并拍照。2实时荧光定量PCR(PT-PC)检测SKOV3细胞及SKOV3/DDP细胞Notch1mRNA表达水平。3四甲基偶氮唑蓝(MTT)法：对SKOV3/DDP细胞以不同浓度的DAPT(25，50，75μmol/L)作用不同时间(24h、48h、72h)，以加入DAPT的溶剂0.375%DMSO为对照组。MTT法检测DAPT对细胞生长的影响，筛选出药物作用的最适浓度及时间。4蛋白印迹法（Western blotting）：检测SKOV3细胞及不同浓度的DAPT(0，25，50，75μmol/L)作用于SKOV3/DDP细胞48h后，上皮标记物E-cadherin和间质标记物vimentin的表达水平。5划痕实验：常规培养SKOV3/DDP细胞使其融合形成单细胞层，无血清培养基同步化24h后，按实验分组加入不同干预（实验组：50μmol/LDAPT；对照组：0.25%DMSO），在培养板底部中央呈“一”字形划痕，分别于给药后0h、24h后倒置显微镜（40×）下观察照相，计算24h内划痕愈合的面积评估细胞的迁移能力。6Transwell实验：以50μmol/L DAPT作用SKOV3/DDP细胞为实验组，以加入0.25%DMSO为对照组，连续培养24小时后取出Transwell侵袭小室，用95%乙醇固定，经结晶紫染色，在显微镜（200×）下拍照并计数移至微孔膜下层的细胞评估细胞的迁移和侵袭能力。7应用SPSS16.0软件进行统计学分析。结果：1SKOV3细胞与SKOV3/DDP细胞：倒置显微镜下观察，SKOV3细胞呈椭圆形、圆形或立方形，呈铺路石样排列，胞间连接紧密，为典型上皮样细胞形态；SKOV3/DDP细胞呈长梭形，细胞排列较松散，胞间连接不紧密，呈间质细胞样形态；Western blotting检测结果示：SKOV3/DDP细胞的E-cadherin表达量低于SKOV3细胞（0.054±0.012VS0.718±0.125），而Vimentin表达量高于SKOV3细胞（3.232±0.267VS0.517±0.059），差别具有统计学意义（P＜0.01）； RT-PCR结果示SKOV3/DDP细胞Notch1mRNA的表达量为SKOV3细胞的3.952倍。2MTT结果示，随着DAPT浓度增加和作用时间的延长，SKOV3/DPP细胞的生长抑制率明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。3Western blotting结果示不同浓度的DAPT（25、50、75μmol/L）作用于SKOV3/DDP细胞48h后，其上皮标记物E-cadherin表达较对照组明显增加（0.207±0.020、0.295±0.011、0.429±0.024VS0.054±0.012）（P＜0.01），且随DAPT作用浓度增加而升高，各组间差异显著（P＜0.01）；间质标记物vimentin表达较对照组明显降低（2.502±0.170、1.873±0.177、1.624±0.057VS3.232±0.266）（P＜0.01），但50μmol/L与75μmol/L浓度组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。4以浓度为50μmol/L的DAPT作用于SKOV3/DDP细胞24h后，划痕试验结果：处理组的划痕愈合面积显著小于对照组（14.31±3.59VS52.91±10.59）（P＜0.01）；Transwell实验结果示处理组穿膜细胞个数明显少于对照组（迁移实验13±2VS37±2，侵袭实验9±1VS27±3），差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论： SKOV3/DDP细胞化疗耐药过程中获得了EMT表型，γ-分泌酶抑制剂DAPT可通过靶向作用于Notch信号通路，部分逆转EMT，抑制人卵巢癌顺铂耐药细胞的增殖、粘附及侵袭转移能力，有望成为有效治疗耐药复发转移EOC的新选择。