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当今社会随着工作节奏加快和生活压力增大，越来越多的人不得不牺牲睡眠以获取更多的时间进行工作。长时间的觉醒伴随着睡眠压力不断上升，往往会导致觉醒状态不稳定、脑高级功能受损。前额叶皮层在工作记忆、情绪调控等许多高级功能中发挥重要作用，并且睡眠剥夺对前额叶皮层的活动和相关功能的影响尤为显著。揭示短期延长觉醒对前额叶皮层活动的影响，将有助于了解其在延长觉醒早期的变化，为改善长时间作业带来的脑高级功能障碍提供神经生物学基础。在短期延长觉醒过程中，大脑皮层的兴奋性逐渐升高。这一变化被认为与活动依赖性的兴奋性突触传递增强有关。然而，神经元对传入刺激产生动作电位的能力，也会影响到皮层的活性。有研究表明，长时间睡眠剥夺会引起海马锥体神经元的内在兴奋性下降。另一方面，皮层神经元的内在兴奋性具有与突触传递类似的活动依赖性增强的特点。但是目前尚不清楚短期延长觉醒后，皮层神经元的内在兴奋性会发生怎样的变化。前额叶皮层广泛接受来自皮层下觉醒系统的支配。其中，外侧下丘脑的orexin和背缝核的5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)对于觉醒状态下维持前额叶皮层的兴奋性、调控其正常功能具有重要意义。据文献显示，大鼠在经历应激后，前额叶皮层5层锥体神经元对orexin和5-HT的反应减弱，给与这些递质所诱发的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic current，EPSC)显著减少。此外，延长觉醒2h后，orexin不能有效激活蓝斑和结节乳头体核，导致刺激orexin神经元所引起的促觉醒效应减弱。然而，在短期延长觉醒下，前额叶皮层神经元对促觉醒递质的反应性会不会发生变化，尚未见报道。本实验首先通过免疫组化观察c-Fos蛋白表达，以验证延长觉醒4h对大鼠内侧前额叶皮层活性的影响。接下来采用离体脑片膜片钳全细胞记录技术，观察延长觉醒4h后，内侧前额叶皮层5层锥体神经元的兴奋性突触传入、内在兴奋性以及对orexin和5-HT的反应情况，并对内在兴奋性变化的机制进行了探讨。然后，运用行为学方法，检测了短期延长觉醒对大鼠前额叶相关功能的影响，以寻找神经元活性变化与整体功能之间的联系。主要结果如下：1．延长觉醒4h后内侧前额叶皮层c-Fos蛋白表达增多采用免疫组化对c-Fos蛋白染色显示，延长觉醒组大鼠内侧前额叶皮层的c-Fos阳性细胞为286.85±11.18/mm~2(n=5)，显著高于对照组221.86±16.64/mm~2(n=5，p<0.05)，提示内侧前额叶皮层活性升高。2．延长觉醒4h后内侧前额叶皮层神经元兴奋性突触传入增强在灌流液中加入GABAA受体阻断剂picrotoxin(100μM)，记录大鼠内侧前额叶皮层5层锥体神经元的EPSC。延长觉醒组大鼠神经元(n=9)的EPSC的平均幅度为13.98±0.14pA，平均频率为1.86±0.19Hz，与对照组大鼠神经元(n=9)的平均幅度11.28±0.13pA和平均频率0.98±0.09Hz相比，均显著增加(p<0.01)，提示延长觉醒后神经元的兴奋性传入增强。3．延长觉醒4h后内侧前额叶皮层神经元的内在兴奋性增高比较对照、延长觉醒组和恢复睡眠组大鼠的内侧前额叶皮层5层锥体神经元的静息膜电位和输入阻抗，未见显著差异(n=22，23和20，p>0.05)，单个动作电位的阈电位、基强度及幅度也没有明显差异(p>0.05)。但是在输入从+80pA到+300pA的跃阶去极化电流的条件下，延长觉醒组大鼠神经元(n=18)产生的动作电位的频率显著高于对照组(n=18)和恢复睡眠组(n=18，p<0.05)。分别计算每个神经元的频率-电流曲线的起始斜率显示，延长觉醒组大鼠神经元的斜率为131.84±4.16，与对照组99.89±4.15和恢复组102.91±5.40相比显著增高(p<0.01)，表明延长觉醒组大鼠神经元对输入刺激产生放电的增益效应提高。并且，即使用谷氨酸受体阻断剂CNQX (10μM)和APV (50μM)抑制兴奋性突触传入，以排除背景突触活动对神经元放电的影响，延长觉醒组大鼠神经元的斜率120.35±6.38(n=7)仍高于对照组91.25±9.03(n=6)和恢复组93.71±10.37(n=6，p<0.05)。通过测量+200pA去极化电流刺激下，第一个峰电位间距(interspike interval，ISI)与第十个峰电位间距的比值(ISI1st/ISI10th)，以及第一个峰电位间距与最后一个峰电位间距的比值(ISI1s/ISIlast)，对动作电位的频率适应进行评估。结果显示，延长觉醒组大鼠神经元的ISI1st/ISI10th和ISI1s/ISIlast分别为0.40±0.04和0.35±0.04(n=18)，显著高于对照组(0.29±0.03和0.26±0.03，n=18)与恢复组(0.29±0.03和0.24±0.02，n=18，p<0.05)，表明延长觉醒组大鼠神经元的频率适应减弱。以上结果均提示延长觉醒后神经元的内在兴奋性升高，而获得恢复性睡眠后内在兴奋性可回到基础水平。4．内在兴奋性增高与簇放电后超极化的变化有关比较三组神经元的簇放电后超极化(post-burst afterhyperpolarization，post-burstAHP)可以看出，延长觉醒组大鼠神经元的簇放电后AHP不管是峰值(3.05±0.23mV，n=22)或面积(1708.66±330.9mV·ms)，均显著低于对照组(6.07±0.26mV，3085.02±290.02mV·ms，n=19)和恢复组(5.61±0.26mV，3212.51±515.45mV·ms，n=15，p<0.01)。相应的，延长觉醒组大鼠神经元的钙依赖的AHP电流(峰值12.84±3.24pA，面积9685.89±1983.34pA·ms，n=7)也显著低于对照组(50.95±14.79pA，41200.98±12429.05pA·ms，n=6)和恢复组(52.86±10.78pA，40990.15±7786.88pA·ms，n=6，p<0.05)。此外，使用200μM CdCl2抑制簇放电后AHP，不但可消除三组神经元在簇放电后AHP上的差异(对照组n=11，延长觉醒组n=12，恢复组n=8，峰值和面积均p>0.05)，并且频率-电流曲线的起始斜率也不再具有显著差异(对照组n=7，延长觉醒组n=7，恢复组n=8，p>0.05)。以上结果提示，延长觉醒后神经元的簇放电后AHP降低，这一变化可能导致了内在兴奋性增高。我们还比较了单个动作电位后的快速AHP(fast AHP，fAHP)，三组神经元(对照组n=16，延长觉醒组n=18，恢复组n=15)没有显著差异(p>0.05)。此外，-200pA的超极化电流诱发的电压sag比值(对照组n=13，延长觉醒组n=10，恢复组n=8)，以及-65mV到-125mV的跃阶电压诱发的超极化激活阳离子电流(对照组n=4，延长觉醒组n=5，恢复组n=6)，在三组大鼠的神经元上也未见差异(p>0.05)。提示延长觉醒4h条件下，fAHP和超极化激活阳离子电流未发生变化。5．延长觉醒4h对orexin-A和5-HT在内侧前额叶皮层神经元效应的影响在灌流0.5μM TTX阻断突触前递质释放的条件下，400nM orexin-A在对照组和延长觉醒组大鼠的内侧前额叶皮层5层锥体神经元上引起去极化反应的反应率(分别为6/16和5/14)及去极化程度(分别为8.25±0.39mV和7.60±1.71mV)均未见显著差异(p>0.05)。此外，在对照组和延长觉醒组大鼠的神经元上，400nM orexin-A和20μM5-HT均可引起EPSC的幅度增加(p<0.01)，时间间隔缩短(p<0.01)。给与orexin-A后，对照组神经元的EPSC频率增加到给药前的147.25±8.05%(n=5)，延长觉醒组神经元的EPSC频率增加到给药前的138.10±6.16%(n=5)，两组之间无显著差异(p>0.05)。加入5-HT后，对照组神经元的EPSC频率增加到给药前的154.34±12.09%(n=6)，延长觉醒组神经元的EPSC频率增加到给药前的136.06±8.29%(n=5)，两组之间也无明显差异(p>0.05)。提示延长觉醒4h后，在所测试的指标中，内侧前额叶皮层5层锥体神经元对orexin-A和5-HT的反应性没有变化。此外，我们在正常大鼠上还观察到orexin-A对内侧前额叶皮层2/3层锥体神经元具有去极化效应，该效应在0.5μM TTX或无钙的灌流液中仍然存在，而orexin受体1拮抗剂SB-334867(1μM)可将orexin-A引起的去极化程度降低到16.11±4.31%(n=5，p<0.01)，并且orexin受体2激动剂[Ala11,D-Leu15]-orexin-B(400nM和1μM)不具有与orexin-A相似的去极化效应(n=4)。提示orexin-A直接通过内侧前额叶皮层2/3层锥体神经元上的orexin受体1引起神经元去极化。6．短期延长觉醒对大鼠行为的影响延长觉醒4h后，大鼠(n=8)的平均睡眠潜伏期为489.77±73.45s，显著低于正常水平721.21±81.67s(p<0.05)，提示困倦程度增加。在T迷宫延迟交替选择任务中，延长觉醒4h对大鼠的表现没有显著影响(n=8，p>0.05)；而延长觉醒8h后，大鼠在延迟30s的任务中正确率(61.25±2.95%)显著低于正常水平(75.00±3.27%，n=8，p<0.01)。提示本实验条件下，延长觉醒4h后工作记忆尚未明显受损，而延长觉醒8h后工作记忆能力下降。在旷场实验中，延长觉醒4h组大鼠(n=8)与其对照组(n=8)相比，水平穿格数明显增加(对照组81.88±14.75，延长觉醒组120.63±10.05，p<0.05)。其余指标中，站立次数、穿中央区次数和中央区停留时间略高于对照组，梳理次数略低于对照组，但无显著差异(p>0.05)。延长觉醒8h组大鼠(n=8)与其对照组(n=8)相比，各项指标均无显著差异(p>0.05)，其中水平穿格数、站立次数、穿中央区次数和中央区停留时间略高于对照组，梳理次数略低于对照组。以上结果可能提示短期延长觉醒后大鼠对新异环境的好奇程度和探索欲望提高。此外，延长觉醒4h后动物在新环境中的活动增多，但随着觉醒时间延长这一变化将消失。综上所述，在延长觉醒早期，大鼠内侧前额叶皮层锥体神经元上的兴奋性突触传入增强，并且神经元的内在兴奋性增高，两者共同导致内侧前额叶皮层的活性增高。这一变化将对动物的整体行为产生一系列的影响。